碱性磷酸酶测定方法(磷酸苯二钠比色法)

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磷酸酶

磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。试验表明,土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用;某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况(特别是磷的状况)。

基本原理:

土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时,能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性:碱性磷酸酶(用PH10的硼酸盐缓冲液),中性磷酸酶(用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液),酸性磷酸酶(用PH5.0的乙酸盐缓冲液)

试剂配制:

1)甲苯

2)0.5% 磷酸苯二钠

3)硼酸盐缓冲液(PH9.6与PH10.0):称取12.404g硼酸(H3BO3)溶于700ml 去离子水,用稀NaOH溶液调节至PH10.0,用去离子水稀释至1000ml

4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂:取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺,用10ml 96%的乙醇溶解,贮于棕色瓶中,存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

5)标准溶液:(a)母液:1g酚溶于蒸馏水中,并稀释至1000ml,溶液保存在暗色瓶中;(b)工作液:10ml溶液(a)稀释至1000ml(1ml含10ug酚)6)0.3%硫酸铝溶液

标准曲线绘制:

取0,1,3,5,7,9,11和13ml酚工作液(b),置于50ml容量瓶中,每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,30min后比色测定。以光密度为纵坐标,浓度为横坐标绘成标准曲线。

操作步骤:

1)取5g风干土置于200ml三角瓶中,用2.5ml甲苯处理

2)处理15min后,加入20ml 0.5%磷酸苯二钠

3)将反应混合物置于37℃恒温箱中,培养24h后,在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。

4) 无土对照:不加土样,其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照

5)无基质对照:对每个土样,设置以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同。

6)比色程序:

取滤液3ml置于50ml容量瓶中,然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓

冲液时,呈现蓝色,在分光光度计上于660nm处比色。

结果计算:

磷酸酶活性,以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示:

酚(mg)=a×8

式中,a——从标准曲线上查得的酚毫克数

8——换算成1g土的系数

以24h后1g土壤中释放出的酚的质量(mg)表示磷酸酶活性。

磷酸酶活性=(a样品-a无土-a无基质)×V×n/m

式中:a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;

V为显色液体积;n为分取倍数,浸出液体积/吸取滤液体积;m表示烘干土重

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