GST融合蛋白表达与纯化
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、重复离心，弃上清，将沉淀重悬于150μl冰冷的20%蔗糖/10mmol/L Tris·Cl（pH7.5）中，充分涡旋混合，加入5μl 0.5mol/L的EDTA（pH8.0）。
3、取出50μl代表总细胞组分的小份，-20℃保存，将剩余的样品置于冰上保持10min，以使EDTA能够将细胞壁结构变疏松。
4、将细胞碎片离心5min，弃上清，在100μl冰水中剧烈涡旋，重悬沉淀。
5、在冰上放置10min，然后离心5min。
6、小心地收集上清（周质组分）于1.5ml离心管中，-20℃保存。
7、用棉签除去沉淀中剩余的液体，在100μl冰水中重悬沉淀，保存此溶液，作为细胞质和膜组分。
8、制备三种组分（全细胞组分、周质组分和胞质/膜组分），进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）
2、用PBS将一小份菌液稀释10倍，用水作空白对照，测OD600值，以证实培养物已达到稳定期（在1cm光径的比色杯中，OD值为1-2；OD值为1时，相当于0.5x109-1x109个/ml）。
3、将一个含有50ml LB培养基（含适当抗生素）的150ml摇瓶放入42℃水浴摇床中，预热培养基。要确保温度准确（过低的温度将导致阻遏物的灭活不完全，诱导不佳），注意某些宿主菌（如大肠杆菌HB101）不能耐受42℃，在此温度下生长明显降低。
超声破碎仪
注意：在整个过程中，细胞都应当置于冰浴中，以使样品的改变降低至最低程度。
1、在50ml离心管中，4℃、4000g离心15min，收获25ml表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主细胞，弃上清，将沉淀重悬于1-1.5ml 25mmol/L的HEPES（pH=7.6），得到OD600的值约为40。
2、将离心管置于冰浴中，超声3次，每次1min，每次脉冲之间间隔30s，以防过热。在1.5ml的微量离心管中取100μl细胞裂解物（总蛋白质），-20℃保存备用。
二、大肠杆菌表达系统的选择
基本方案一在pL启动子控制下的表达：温度诱导
与含有pL启动子载体一起使用的大肠杆菌宿主菌必须含有一种由cI857编码的温度敏感的阻遏蛋白，或作为休眠噬菌体整合到宿主的染色体中，或构建在携带外源基因的同一质粒中。在高温下，cI857基因的表达被灭活，呈现阻遏作用，使pL启动子下游的基因转录。细胞首先在30℃生长至理想的密度，然后将温度升至42℃，便可诱导蛋白质的合成，合适的抗生素是由表达载体决定的。
6、加入400xIAA贮液至终浓度为1xIAA（25μg/ml）诱导蛋白表达，继续培养3h，取第二份（终）1ml样品。
7、对于每个1ml样品，于室温下，用最大速度离心2min，弃去上清，进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，-20℃保存沉淀物。
8、用剩余的培养物来分析蛋白的可溶性（见辅助方案3）、蛋白质在周质（见辅助方案4）或培养基中（见辅助方案5）的定位，或分析质粒稳定性。如果希望，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。
2、在加热块中加热至90℃，保持5min。按SDS-PAGE进行操作。
辅助方案3 可溶性分析
为了确定后续的纯化策略，需要分析重组蛋白的可溶性（见第6.1单元）。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主菌株
25mmol/L HEPES（pH=7.6；高压，4℃保存可达1年）
50ml和5ml离心管
离心机（如Sorvall RC5B，带SS34转头），4℃
辅助方案5 细胞外培养基样品的制备
通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。如果培养物中蛋白质浓度很低（如低于100mg/L），可以加入牛血清白蛋白（BSA）作为沉淀的载体和核。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
2g/L BSA（可选；用0.22μm的膜除菌，4℃保存≤1个月）
图3存在于天然宿主细胞中的可溶性蛋白质的纯化图解。必须将细胞破碎，以释放出蛋白质，通常每克细胞加入2-10ml适当的缓冲液，在除去不溶性材料后，处理通常需要几步，按正确的顺序使用各种标准的分级分离方法。要生产高纯度蛋白质，可能会需要最后的精致步骤，以除去最终的微量污染物。
图4与膜相关的和溶解性差的蛋白质（非重组的）的纯化图解。通过分离含有目的蛋白的细胞器，可以实现第一步的纯化。通常用非离子型去污剂来溶解膜蛋白，尽管松散解离的蛋白质也可以在高pH、含EDTA（或使用少量的有机溶剂，如正丁醇）的条件下不用去污剂来提取，如果自始至终都需要有去污剂来维持蛋白质的完整性，则需要对常规的分级分离方法进行一些修改。
6、用剩余的50ml培养物来分析质粒的稳定性、确定样品的可溶性（见辅助方案3）或制备周质提取物或细胞外培养基样品（见辅助方案4和5）以获得重组蛋白。如果要保存的话，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。
基本方案2 在trp启动子控制下的表达：化学诱导
细胞在最低营养培养基中生长至对数生长期，以获得色氨酸饥饿，用色氨酸类似物吲哚-3-丙烯酸灭活残余的trp阻遏物。
辅助方案2SDS-PAGE分析样品的制备
目的是在变性条件下将样品中的所有蛋白质溶解到溶液中，以便在SDS胶中通过一维电泳能够分辨混合物。如果必要，制备过量的样品，以便能够在几块胶上重复上样。一旦在SDS样品缓冲液中溶解，样品便能够在-20℃保存多年。
材料（带√的项见附录1）
目的样品（见基本方案1和2、备择方案1和2）
2、核实细胞处于稳定期（OD600为1-2），用50μl接种含有2ml LB培养基（加入适当的抗生素）的20ml的培养管，培养2-3h。
3、在每个冷冻管中加入0.9ml培养物，标记，充分旋涡混合，立即冷冻，于-80℃保存冷冻后的菌株。
4、要从冷冻保存物开始新的培养，用无菌环刮冷冻管的表面，然后在LB平板上划线，或浸入液体培养基中，将冷冻管放回-80℃保存。
2、用水作空白对照，测OD600。
3、将过夜培养物移至含有50ml M9培养基/酪蛋白水解物（补加适量的抗生素）的150ml培养管内。
4、取1ml起始样品，立即按第7步的方法进行处理或-20℃保存。
5、在37℃定轨摇床中，剧烈振荡（200rpm）将培养物温浴1-2h，测OD600，以确保细胞进入完全对数生长期（OD600为0.2-0.5）。
材料（带√的项见附录1）
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
√PBS
20%蔗糖（m/V）/10mmol/L Tris·Cl（pH7.5；附录1），冰冷
√0.5mol/L EDTA（pH8.0）
冰冷水
注意：在整个过程中，细胞都应当置于冰浴中，以使样品的改变降至最低程度。
1、在1.5ml离心管中放入约2x109个表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞（OD600为1时相当于约109个细胞），4℃，最大转速离心2min，弃上清，将沉淀重悬于1ml PBS中，将管子充分涡旋混合。
转化的大肠杆菌宿主菌株
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
√20%（V/V）甘油，无菌的
√LB平板
20ml培养管
30℃或37℃定轨摇床
1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落，接种2ml LB培养基（补加适当的抗生素；在20ml培养管中），在定轨摇床上培养过夜。对于基于pL的系统，温度为30℃，对于其他系统，温度为37℃。
材料（带√的项见附录1）
含有在pL启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株（如Coli B、W3110）
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
20ml无菌培养管
42℃水浴摇床
150ml摇瓶，无菌
1、制备少量大肠杆菌宿主菌株的液体培养物，该大肠杆菌是由处于稳定期的含有在pL启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的。方法是：从新鲜的LB琼脂平板上挑单菌落，接种于含2ml LB培养基（补加适当的抗生素贮液）的20ml管中，将培养管在30℃旋转摇床中200rpm温浴过夜，不要超过30℃。
备择方案1 在lac/tac启动子控制下的表达
对于lac启动子或tac启动子（lac和tac启动子的杂交体）控制下的蛋白质表达，通常往培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使lac阻遏物释放，从而诱导表达。宿主菌必须在染色体或质粒（含目的基因的质粒或兼容的质粒）中含有lac I阻遏物基因。对于这些启动子，按基本方案2（trp启动子）进行操作，但应当用适当转化的宿主菌作为其实材料，而且第6步的诱导，用100xIPTG（终浓度为0.4-1.0mmol/L；见附录1）代替400xIAA。
√2xSDS样品缓冲液
牙签，无菌的
超声破碎仪（Branson公司，带微探头）
1a、可溶性样品：在1.5ml的微量离心管中，将样品加到等体积的2xSDS样品缓冲液中。
1b、沉淀物样品：用无菌牙签将5-10mg的沉淀物移至一个预先称重的1.5ml的微量离心管中，称重沉淀物。每10mg加入400μl 1xSDS样品缓冲液，在30-50W功率下超声10s重悬，始终将超声破碎仪探头置于液面下面，以防止产生泡沫。
一、蛋白质纯化流程图
图1可溶性重组蛋白的纯化图解，这种蛋白质可以被分泌或定位在周质内、膜组分内，或在大多数情况下在细胞质内。第一步是得到含有可溶性目的蛋白的提取物，之后可以进行常规的纯化步骤，或用亲和方法纯化带有标签的融合蛋白。
图2在宿主细胞的细胞质中以包含体形式生产的不可溶性重组蛋白的纯化图解。必须将细胞破碎开，然后通过差异离心分离不可溶的包含体，使用变性溶剂来溶解，当除去变性剂后，溶解的蛋白质发生复性，还需要进一步的精制步骤来除去少量的污染蛋白质和未正确折叠的蛋白质。
材料（带√的项见附录1）
用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株
√M9最低营养培养基加0Βιβλιοθήκη Baidu5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）
√1000x抗生素贮液
√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）
20ml无菌培养管
150ml摇瓶
37℃定轨摇床
1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。
3、将悬液移至5ml的离心管中，4℃、30000g（在SS34转头中为16000rpm）离心30min，将上清（可溶组分）倒入另一个5ml的管中，使其与沉淀物（不可溶组分）分开。
4、制备三种组分（总组分、可溶组分和不可溶组分），用于SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。
辅助方案4 周质提取物的制备
本方案叙述了用小规模的方法来证实蛋白质表达定位于大肠杆菌周质间隙中。
4、将2ml过夜培养物转移至含有预热培养基的瓶中，取1ml样品，按第5步所述的方法进行处理。将50ml培养物放回42℃水浴摇床中，在剧烈振荡（200rpm）下温浴3h。在温浴的最后，取另外1ml样品。在接种和取样品时，操作要快，以保持温度稳定。
5、在室温条件下，用最大速度离心每种样品2min，弃去上清，进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，在SDS-PAGE前，沉淀物可于-20℃长期保存。
备择方案2T7 RNA聚合酶/启动子表达系统
这种方案是通过具有高度活性和效率的T7 RNA聚合酶的lacUV5启动子进行诱导，它与T7启动子（pT7）结合，并在其控制下转录基因。该方案使用大肠杆菌宿主菌，该宿主菌DNA中整合有lacUV5控制下的T7 RNA聚合酶基因，同时该宿主菌转化有在pT7控制下的氨苄青霉素抗性基因和目的蛋白基因的质粒DNA。对于这种系统，可按基本方案2（trp启动子）的步骤进行操作，但应当用适当转化的宿主菌作为起始材料，使用氨苄青霉素选择，而且第6步的诱导，用100xIPTG（终浓度为0.5-1mmol/L；见附录1）代替400xIAA。
将该系统进行改造，使其能够通过第二个质粒（如pLysE或pLysS，它们也编码氯霉素抗性）诱导T7溶菌酶（它与聚合酶结合，这样便在非诱导条件下停止转录），而且且能够在第二种抗生素选择下维持生存。因此还可以利用第二种抗生素（如30mg/L的氯霉素）进行选择。
辅助方案1 菌株保存
材料（带√的项见附录1）
200g/L的三氯醋酸（TCA；用0.22μm的滤器除菌，4℃保存≤1个月）
70%（V/V）乙醇
适于水溶液的0.22μm膜
1、在1.5ml的微量离心管中放入1ml表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物，4℃，最高转速离心2min，收集上清，将其过0.22μm的膜，收入1.5ml的微量离心管中，弃沉淀。
3、取出50μl代表总细胞组分的小份，-20℃保存，将剩余的样品置于冰上保持10min，以使EDTA能够将细胞壁结构变疏松。
4、将细胞碎片离心5min，弃上清，在100μl冰水中剧烈涡旋，重悬沉淀。
5、在冰上放置10min，然后离心5min。
6、小心地收集上清（周质组分）于1.5ml离心管中，-20℃保存。
7、用棉签除去沉淀中剩余的液体，在100μl冰水中重悬沉淀，保存此溶液，作为细胞质和膜组分。
8、制备三种组分（全细胞组分、周质组分和胞质/膜组分），进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）
2、用PBS将一小份菌液稀释10倍，用水作空白对照，测OD600值，以证实培养物已达到稳定期（在1cm光径的比色杯中，OD值为1-2；OD值为1时，相当于0.5x109-1x109个/ml）。
3、将一个含有50ml LB培养基（含适当抗生素）的150ml摇瓶放入42℃水浴摇床中，预热培养基。要确保温度准确（过低的温度将导致阻遏物的灭活不完全，诱导不佳），注意某些宿主菌（如大肠杆菌HB101）不能耐受42℃，在此温度下生长明显降低。
超声破碎仪
注意：在整个过程中，细胞都应当置于冰浴中，以使样品的改变降低至最低程度。
1、在50ml离心管中，4℃、4000g离心15min，收获25ml表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主细胞，弃上清，将沉淀重悬于1-1.5ml 25mmol/L的HEPES（pH=7.6），得到OD600的值约为40。
2、将离心管置于冰浴中，超声3次，每次1min，每次脉冲之间间隔30s，以防过热。在1.5ml的微量离心管中取100μl细胞裂解物（总蛋白质），-20℃保存备用。
二、大肠杆菌表达系统的选择
基本方案一在pL启动子控制下的表达：温度诱导
与含有pL启动子载体一起使用的大肠杆菌宿主菌必须含有一种由cI857编码的温度敏感的阻遏蛋白，或作为休眠噬菌体整合到宿主的染色体中，或构建在携带外源基因的同一质粒中。在高温下，cI857基因的表达被灭活，呈现阻遏作用，使pL启动子下游的基因转录。细胞首先在30℃生长至理想的密度，然后将温度升至42℃，便可诱导蛋白质的合成，合适的抗生素是由表达载体决定的。
6、加入400xIAA贮液至终浓度为1xIAA（25μg/ml）诱导蛋白表达，继续培养3h，取第二份（终）1ml样品。
7、对于每个1ml样品，于室温下，用最大速度离心2min，弃去上清，进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，-20℃保存沉淀物。
8、用剩余的培养物来分析蛋白的可溶性（见辅助方案3）、蛋白质在周质（见辅助方案4）或培养基中（见辅助方案5）的定位，或分析质粒稳定性。如果希望，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。
2、在加热块中加热至90℃，保持5min。按SDS-PAGE进行操作。
辅助方案3 可溶性分析
为了确定后续的纯化策略，需要分析重组蛋白的可溶性（见第6.1单元）。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主菌株
25mmol/L HEPES（pH=7.6；高压，4℃保存可达1年）
50ml和5ml离心管
离心机（如Sorvall RC5B，带SS34转头），4℃
辅助方案5 细胞外培养基样品的制备
通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。如果培养物中蛋白质浓度很低（如低于100mg/L），可以加入牛血清白蛋白（BSA）作为沉淀的载体和核。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
2g/L BSA（可选；用0.22μm的膜除菌，4℃保存≤1个月）
图3存在于天然宿主细胞中的可溶性蛋白质的纯化图解。必须将细胞破碎，以释放出蛋白质，通常每克细胞加入2-10ml适当的缓冲液，在除去不溶性材料后，处理通常需要几步，按正确的顺序使用各种标准的分级分离方法。要生产高纯度蛋白质，可能会需要最后的精致步骤，以除去最终的微量污染物。
图4与膜相关的和溶解性差的蛋白质（非重组的）的纯化图解。通过分离含有目的蛋白的细胞器，可以实现第一步的纯化。通常用非离子型去污剂来溶解膜蛋白，尽管松散解离的蛋白质也可以在高pH、含EDTA（或使用少量的有机溶剂，如正丁醇）的条件下不用去污剂来提取，如果自始至终都需要有去污剂来维持蛋白质的完整性，则需要对常规的分级分离方法进行一些修改。
6、用剩余的50ml培养物来分析质粒的稳定性、确定样品的可溶性（见辅助方案3）或制备周质提取物或细胞外培养基样品（见辅助方案4和5）以获得重组蛋白。如果要保存的话，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。
基本方案2 在trp启动子控制下的表达：化学诱导
细胞在最低营养培养基中生长至对数生长期，以获得色氨酸饥饿，用色氨酸类似物吲哚-3-丙烯酸灭活残余的trp阻遏物。
辅助方案2SDS-PAGE分析样品的制备
目的是在变性条件下将样品中的所有蛋白质溶解到溶液中，以便在SDS胶中通过一维电泳能够分辨混合物。如果必要，制备过量的样品，以便能够在几块胶上重复上样。一旦在SDS样品缓冲液中溶解，样品便能够在-20℃保存多年。
材料（带√的项见附录1）
目的样品（见基本方案1和2、备择方案1和2）
2、核实细胞处于稳定期（OD600为1-2），用50μl接种含有2ml LB培养基（加入适当的抗生素）的20ml的培养管，培养2-3h。
3、在每个冷冻管中加入0.9ml培养物，标记，充分旋涡混合，立即冷冻，于-80℃保存冷冻后的菌株。
4、要从冷冻保存物开始新的培养，用无菌环刮冷冻管的表面，然后在LB平板上划线，或浸入液体培养基中，将冷冻管放回-80℃保存。
2、用水作空白对照，测OD600。
3、将过夜培养物移至含有50ml M9培养基/酪蛋白水解物（补加适量的抗生素）的150ml培养管内。
4、取1ml起始样品，立即按第7步的方法进行处理或-20℃保存。
5、在37℃定轨摇床中，剧烈振荡（200rpm）将培养物温浴1-2h，测OD600，以确保细胞进入完全对数生长期（OD600为0.2-0.5）。
材料（带√的项见附录1）
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
√PBS
20%蔗糖（m/V）/10mmol/L Tris·Cl（pH7.5；附录1），冰冷
√0.5mol/L EDTA（pH8.0）
冰冷水
注意：在整个过程中，细胞都应当置于冰浴中，以使样品的改变降至最低程度。
1、在1.5ml离心管中放入约2x109个表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞（OD600为1时相当于约109个细胞），4℃，最大转速离心2min，弃上清，将沉淀重悬于1ml PBS中，将管子充分涡旋混合。
转化的大肠杆菌宿主菌株
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
√20%（V/V）甘油，无菌的
√LB平板
20ml培养管
30℃或37℃定轨摇床
1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落，接种2ml LB培养基（补加适当的抗生素；在20ml培养管中），在定轨摇床上培养过夜。对于基于pL的系统，温度为30℃，对于其他系统，温度为37℃。
材料（带√的项见附录1）
含有在pL启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株（如Coli B、W3110）
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
20ml无菌培养管
42℃水浴摇床
150ml摇瓶，无菌
1、制备少量大肠杆菌宿主菌株的液体培养物，该大肠杆菌是由处于稳定期的含有在pL启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的。方法是：从新鲜的LB琼脂平板上挑单菌落，接种于含2ml LB培养基（补加适当的抗生素贮液）的20ml管中，将培养管在30℃旋转摇床中200rpm温浴过夜，不要超过30℃。
备择方案1 在lac/tac启动子控制下的表达
对于lac启动子或tac启动子（lac和tac启动子的杂交体）控制下的蛋白质表达，通常往培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使lac阻遏物释放，从而诱导表达。宿主菌必须在染色体或质粒（含目的基因的质粒或兼容的质粒）中含有lac I阻遏物基因。对于这些启动子，按基本方案2（trp启动子）进行操作，但应当用适当转化的宿主菌作为其实材料，而且第6步的诱导，用100xIPTG（终浓度为0.4-1.0mmol/L；见附录1）代替400xIAA。
√2xSDS样品缓冲液
牙签，无菌的
超声破碎仪（Branson公司，带微探头）
1a、可溶性样品：在1.5ml的微量离心管中，将样品加到等体积的2xSDS样品缓冲液中。
1b、沉淀物样品：用无菌牙签将5-10mg的沉淀物移至一个预先称重的1.5ml的微量离心管中，称重沉淀物。每10mg加入400μl 1xSDS样品缓冲液，在30-50W功率下超声10s重悬，始终将超声破碎仪探头置于液面下面，以防止产生泡沫。
一、蛋白质纯化流程图
图1可溶性重组蛋白的纯化图解，这种蛋白质可以被分泌或定位在周质内、膜组分内，或在大多数情况下在细胞质内。第一步是得到含有可溶性目的蛋白的提取物，之后可以进行常规的纯化步骤，或用亲和方法纯化带有标签的融合蛋白。
图2在宿主细胞的细胞质中以包含体形式生产的不可溶性重组蛋白的纯化图解。必须将细胞破碎开，然后通过差异离心分离不可溶的包含体，使用变性溶剂来溶解，当除去变性剂后，溶解的蛋白质发生复性，还需要进一步的精制步骤来除去少量的污染蛋白质和未正确折叠的蛋白质。
材料（带√的项见附录1）
用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株
√M9最低营养培养基加0Βιβλιοθήκη Baidu5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）
√1000x抗生素贮液
√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）
20ml无菌培养管
150ml摇瓶
37℃定轨摇床
1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。
3、将悬液移至5ml的离心管中，4℃、30000g（在SS34转头中为16000rpm）离心30min，将上清（可溶组分）倒入另一个5ml的管中，使其与沉淀物（不可溶组分）分开。
4、制备三种组分（总组分、可溶组分和不可溶组分），用于SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。
辅助方案4 周质提取物的制备
本方案叙述了用小规模的方法来证实蛋白质表达定位于大肠杆菌周质间隙中。
4、将2ml过夜培养物转移至含有预热培养基的瓶中，取1ml样品，按第5步所述的方法进行处理。将50ml培养物放回42℃水浴摇床中，在剧烈振荡（200rpm）下温浴3h。在温浴的最后，取另外1ml样品。在接种和取样品时，操作要快，以保持温度稳定。
5、在室温条件下，用最大速度离心每种样品2min，弃去上清，进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，在SDS-PAGE前，沉淀物可于-20℃长期保存。
备择方案2T7 RNA聚合酶/启动子表达系统
这种方案是通过具有高度活性和效率的T7 RNA聚合酶的lacUV5启动子进行诱导，它与T7启动子（pT7）结合，并在其控制下转录基因。该方案使用大肠杆菌宿主菌，该宿主菌DNA中整合有lacUV5控制下的T7 RNA聚合酶基因，同时该宿主菌转化有在pT7控制下的氨苄青霉素抗性基因和目的蛋白基因的质粒DNA。对于这种系统，可按基本方案2（trp启动子）的步骤进行操作，但应当用适当转化的宿主菌作为起始材料，使用氨苄青霉素选择，而且第6步的诱导，用100xIPTG（终浓度为0.5-1mmol/L；见附录1）代替400xIAA。
将该系统进行改造，使其能够通过第二个质粒（如pLysE或pLysS，它们也编码氯霉素抗性）诱导T7溶菌酶（它与聚合酶结合，这样便在非诱导条件下停止转录），而且且能够在第二种抗生素选择下维持生存。因此还可以利用第二种抗生素（如30mg/L的氯霉素）进行选择。
辅助方案1 菌株保存
材料（带√的项见附录1）
200g/L的三氯醋酸（TCA；用0.22μm的滤器除菌，4℃保存≤1个月）
70%（V/V）乙醇
适于水溶液的0.22μm膜
1、在1.5ml的微量离心管中放入1ml表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物，4℃，最高转速离心2min，收集上清，将其过0.22μm的膜，收入1.5ml的微量离心管中，弃沉淀。