三氯化铁分光光度法测定全血胆碱酯酶活性 王小鹏

三氯化铁分光光度法测定全血胆碱酯酶

原理：在血液胆碱酯酶作用下，乙酰胆碱发生水解；剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应生成乙酰羟胺，后者在酸性条件下，与三氯化铁反应生成红棕色羟肟酸铁配合物，呈色强度与剩余乙酰胆碱的量成正比，在５２０ｎｍ波长处比色，间接测定血中胆碱酯酶活性。此法最低检测浓度２.４μmol/L（20μl血样），测定范围2.4~1000.0μmol/L。

步骤：1、标准的配制：取6支比色管，分别加入0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，7μmol/ml的氯化乙酰胆碱标准溶液，加标准缓冲液（PBS）至1.0ml，各加1.0ml水，配制成乙酰胆碱含量为：0.0、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0μmol标准溶液系列。向各管中加入4.0ml 碱性羟胺，振摇2min。加2.0ml盐酸溶液，振摇2min。加2.0ml三氯化铁溶液，振摇。溶液与520nm处，以第一管为参比，测定吸光度值。以乙酰胆碱含量（μmol）对相应的吸光度值绘制标准曲线。

2、样品的处理：取4支比色管，分别为1（A,B）和2（A,B），向各管加入0.98mlPBS，20μl血样。置于37℃水浴中预热5min。向1和2的A管加入1.0ml乙酰胆碱标准溶液。自加入乙酰胆碱开始计时，在37℃左右（正负0.5℃）准确反应30min，每间隔10min振摇1次，同时，向1和2的B管加入1.0ml乙酰胆碱标准溶液，充分振摇。取出比色管，各管立即加入4.0ml碱性羟胺溶液，充分振摇2min。然后，A和B管各加2.0ml盐酸溶液，振摇2min。加2.0ml三氯化铁溶液，振摇后样品离心。滤液与520nm处，以标准第一管为参比，测定吸光度。分别用各管吸光度值计算其中乙酰胆碱剩余量，从而得

出1,2号管胆碱酯酶活性。

实验数据及结果：标准曲线吸光度值如下表

表1标准曲线吸光度值

0 1.4 2.8 4.2 5.6 7.0

胆碱酯酶

溶液体积

吸光度值0.004 0.139 0.260 0.395 0.475 0.600

可得标准曲线为：y=0.081x+0.028 拟合方程为R2=0.994

样品吸光度如下表

表2样品吸光度

1号2号

A管0.576 0.555

B管0.643 0.656

1A中含有乙酰胆碱的量是6.7654 1B中含有7.5926 消耗乙酰胆碱为0.8272μmol

2A中含有乙酰胆碱的量为6.5061 2B中含有7.7531 消耗乙酰胆碱量为1.247μmol

由此数据可知2号管中乙酰胆碱消耗量大，估1号内乙酰胆碱酶活性被抑制为注射有有机磷农药的小鼠血样。

讨论：1、此次实验中可能带来误差的地方有标准曲线的配制过程，标准的测定。

2、测定样品浓度由低到高。如此则可以不需要润洗比色皿，在日后工作中处理大量样品时节约时间大有帮助。

3、不规范实验步骤：此次实验并没有严格按照实验步骤要求的标准与样品同时测定，而是先进行的标准曲线的测定，后进行的样品测定。

4、此次实验的影响因素主要有温度与时间，反应时间不够则反应无法彻底进行，会影响实验结果。另外酶活性和温度也有关系，由于在同等温度下，故温度带来的影响可忽略不计。