外泌体提取方法比较

??外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。

外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种

疾病的发生和进程密切相关[1][2]。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药

物的天然载体用于临床治疗。

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取

分离：

1、超速离心法（差速离心）

超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离

到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可

能对囊泡造成损害，从而降低其质量[3]。

2、密度梯度离心

在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通

过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。

3、超滤离心[4]

由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。

4、磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白）[5]，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体

囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外

泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

5、PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存

在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除

的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。??? 6、试剂盒提取

近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤

掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外

泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐

渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。有些试剂盒操作简便，不用超速离心，同时可

获得高纯度和高回收率的外泌体——如101bio开发的系列试剂盒，可分别针对尿液、血液、细

胞上清液等多种样品进行提取[6][7]，并可进一步从外泌体中获得想要的蛋白质或者RNA分子，

方便快速，因而受到大多数人的欢迎，并发表了不少高质量的文章！

然而，市场上各类产品纯化效果良莠不齐，目前仍没有绝对的方法或试剂盒能满足所有要求，

从各类样品中分离到理想的外泌体。

参考文献：

[1] 卢婉, 杨人强, 王伶. 外泌体的研究进展[J]. 生命的化学, 2013, 04期(04).

[2] Taixue An et al. Exosomes serve as tumour markers for personalized diagnostics owing to their important role in cancer metastasis[J]. Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27522.

[3] Richard J. Lobb et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J]. Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27031.

[4] 胡国文,李青,牛鑫等. 旋转超滤：一种提取细胞外泌体的新方法[J]. 第二军医大学学报, 2014,

35(6): 598-602.

[5] Zhang et al. Exosomes in cancer: small particle, big player[J]. Journal of Hematology & Oncology, 2015, 8:83. doi:10.1186/s13045-015-0181-x.

[6] Korbelik M et al.?Ceramide and Sphingosine-1-Phosphate/Sphingosine act as Photodynamic Therapy-Elicited Damage-Associated Molecular Patterns: Release from Cells and Impact on Tumor-Associated Macrophages. Janal Bioanal Tech.?S1:009. doi: 10.4172/2155-9872.S1-009.

[7]Chen?L.,?Chen?R.,?Brigstock?D.?MicroRNA?profiling?of?circulating?exosomes?during?experiment al?liver?fibrosis.Hepatology.?AASLD?abstract,?2014?Oct.?(Presidential?Honored?Distinct?Abstract). ?