烟草叶片愈伤组织诱导与分化试验设计方案

烟草叶片愈伤组织诱导与分化试验设计方案

生物112班第5组

一、实验目的：诱导烟草叶片长出愈伤组织

二、实验用具：超净工作台、镊子、手术剪、酒精灯、培养皿、广口瓶、高压灭菌锅等。

三、实验材料与试剂

1．实验材料烟草叶片

2．试剂 MS培养基、75%酒精、0.1%升汞、无菌水、6BA( 0.1mg/mL) , NAA(0.1mg/ml)等

四、实验方法与步骤

1．培养基的制备与灭菌

按配制培养基的方法配制MS基本培养基250mL。根据实验目的，采用培养基配方为MS+6BA(1.8mg/L) +NAA(1.0mg/L)。所有培养基均附加30g/L蔗糖，4g/L琼脂粉。在高压灭菌前将pH用1mol/LNaOH 调至5.8，然后分装到三角瓶，每瓶分装培养基大约40-50mL。

2．试剂、无菌水及培养皿的准备配制75%的酒精、0.1%升汞；将蒸馏水装入三角瓶或广口瓶，每瓶装50-60 mL，按照培养基灭菌的方法灭菌30min，即可获得无菌水；将剪裁好的滤纸放入洗净的培养皿中，每培养皿放3层，加少量蒸馏水润湿后，用牛皮纸或两层报纸将培养皿包严，高压灭菌30 min后备用。

3．接种室准备首先，用纱布蘸取75%酒精擦拭工作台台面，将接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于工作台上，打开工作台开关

和紫外线灯，确认工作台正常送风后，开机30 min。然后，用喷雾器向接种室空中喷洒75%酒精或打开接种室内的紫外线灯，进行空气灭菌。

4. 培养材料的表面灭菌从盆栽烟草植株上选取鲜绿、肥厚且充分展开的叶子，先用自来水冲洗30 min，用蒸馏水漂洗3次，然后在无菌条件下将其剪成适宜大小，放入广口瓶中。先倒入75%酒精，摇动两三下（10s），立即将酒精倒出，然后加入0.1%升汞溶液，浸泡7min。注意加入的升汞溶液应浸过叶片，浸泡过程中要不断摇动。最后，将升汞倾出，加入无菌水摇动20-30 s倒出，重复用无菌水冲洗5次，备用。

5. 接种将经过表面灭菌的叶片按照无菌操作的要求取出，放入打开的无菌培养皿内。

用手术剪将叶缘剪掉（特别是边缘受升汞损伤的部分），然后将叶片剪成1~2cm2大小，接种到已准备好的培养基中，每瓶接种3个外植体。注意使接种材料在培养基中均匀分散开，并且让叶背接触培养基。

6. 培养将材料置培养室内培养。培养温度25℃左右，光强1000~1500lx，每日光照14h。

7. 观察定期观察记录接种叶片所发生的变化以及愈伤组织的形成和芽分化情况等。在培养7d时统计污染率，详细观察污染物的

分布、菌落形态，并分析是细菌污染还是真菌污染。

8. 结果与分析

本试验培养目的是，共有培养物瓶。

污染情况统计：其中细菌性污染瓶，真菌性污染瓶；污染率％；

诱导分化情况统计：诱导获得愈伤瓶，诱导生根瓶，诱导生芽瓶；

造成污染的原因有：

诱导分化成功的经验或失败的教训是：

小组成员签名：

年月日参考文献

王磊，宿红艳，王媛等.温度对烟草愈伤组织细胞凋亡的影响[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）2008.34（1）