流式细胞仪

z 光学系统
FCM光学系统是由若干透镜组、滤光片和小孔组 成，它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的电 子探测器。
488 nm laser
- Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
461
• POPO-1
434
456
• YOYO-1
491
509
• Acridine Orange (RNA)
460
650
• Acridine Orange (DNA)
502
536
• Thiazole Orange (vis)
509
525
• TOTO-1
514
533
• Ethidium Bromide
V 80年代则是流式细胞仪的商品化时期，这期间不断有 新型号的仪器推出，在多参数检测技术上不断提高。
Typical Research Cytometer (Coulter 753) (1980s)
Detectors
$200-300,000 Lasers
Computers
Fluidics Laser Power Supply
选取FSC做阈值来排除样品 中的各种碎片及鞘液中的 小颗粒，以避免对被测细 胞的干扰。
z 信号检测与存贮、显示、分析系统
当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，细胞 内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以 细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射和 荧光信号。
与激光束正交90°方向的散 射光信号
526
604
• PI (uv/vis)
536
620
• 7-Aminoactinomycin D (7AAD)
555
655
荧光信号线性测量和对数测量：主要由电子线路完成
荧光信号 滤色片
PMT
放大器
对数放大器
细胞膜表面抗原的 分布，阳性群、阴 性群同时显示
线性放大器
细胞DNA含量、 RNA含量、总蛋白 质含量测定
给水滴充电的脉冲不是在做出分选决定时立即产生 并加到流束上的，而是当细胞到达分离点时才加上 的。喷孔的直径、细胞与激光束相交点的位置等因 素会影响这个过程的时间。
由细胞通过测量区到小水滴分离的时间大约为几十 毫秒，称为延迟时间。精确的测定延迟时间是决定 分选质量的关键。
测定所需平均延迟时间的不准确性、喷射液流的变 化、水滴分离点的变化、细胞本身对水滴形成条件 的影响等因素会使延迟时间受到一系列影响。
由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转三部 分组成。
1. 小水滴的形成
通过压电晶体的振动使自喷孔喷出的流束形成 水滴。
喷嘴的振动频率即为每秒钟产生水滴的数目。 若喷嘴直径为50μm，信号频率为40kHz，则每 秒钟产生4万个水滴。
2. 逻辑电路
为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪 个细胞满足分选条件，并产生一个逻辑信号，此信 号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。
Publications using the keyword “flow cytometry” from
1122000000 1100000000
88000000 1st
66000000 44000000 22000000
00
62,496 references (2002)
The growth of diagnostic and phenotypic determination technologies
V 进入21世纪后，各种不同规格的流式细胞仪产品多 种多样，小型化、多功能、高效率成为发展趋势。
• •1199775-5-11979766 • •1199776-6-11979777 • •1199777-7-11979788 • •1199778-8-11979799 • •1199779-9-11989800 • •1199880-0-11989811 • •1199881-1-11989822 • •1199882-2-11989833 • •1199883-3-11989844 • •1199884-4-11989855 • •1199885-5-11989866 • •1199886-6-11989877 • •1199887-7-11989888 • •1199888-8-11989899 • •1199889-9-11999900 • •1199990-0-11999911 • •1199991-1-11999922 • •1199992-2-11999933 • •1199993-3-11999944 • •1199994-4-11999955 • •1199995-5-11999966 • •1199996-6-11999977 • •1199997-7-11999988 • •1199998-8-11999999 • •1199999-9-22000000 • •2200000-0-22000011 • •2200001-1-22000022
3
Probes for Proteins
Probe
Excitation Emission
FITC
488
525
PE
488
575
APC
630
650
PerCP™
488
680
Cascade Blue
360
450
Coumerin-phalloidin
350
4Hale Waihona Puke Baidu0
Texas Red™
610
630
Tetramethylrhodamine-amines
流式细胞仪（Flow Cytometer)
流式细胞仪是一种新型高科技仪器，涉及的技术有： 激光技术、流体力学技术、电子物理技术、光电测量 技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗 体技术等。
应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞 或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的 技术称为流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）。
z 信号检测与存贮、显示、分析系统
当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，细胞 内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以 细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射和 荧光信号。
散射光 信号
不依赖任何细 胞样品的制备 技术
前向角散射 （FSC)
与被测细胞的大小有关： 与细胞直径的平方密切相 关。
散射光 信号
侧向角散 射(SSC)
不依赖任何细 胞样品的制备 技术
对细胞膜、细胞质、核膜 的折射率敏感，可提供细 胞内精细结构和颗粒性质 的信息
z 信号检测与存贮、显示、分析系统
荧光信号
依赖细胞样品 的制备技术
细胞自发荧光： 细胞自身发出的微弱荧 光信号
细胞标记荧光： 经过特异荧光标记物标 记，受激发照射得到的 荧光信号，对其进行检 测和定量分析可对样品 细胞进行定性、定量分 析。
z 激光光源及光束形成系统 台式机一般采用氩离子气体激光器，有些仪器可增 配小功率半导体激光器（635nm），拓宽其染料的 应用范围。
氩离子激光器主要输出波长有：514.5nm， 488nm，496.5nm，476.5nm，452.9nm
Primary laser ：excitation at 488 nm Second laser：excitation at 351-364 nm Third laser ：excitation at 568-647 nm
550
575
CY3 (indotrimethinecyanines)
540
575
CY5 (indopentamethinecyanines)
640
670
Probes for Nucleic Acids
• Hoechst 33342 (AT rich) (uv)
346
460
• DAPI (uv)
359
生物学颗粒分析原理
z 将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后， 放入样品管。
z 在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液 形成样品垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的 轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流 动，形成包绕细胞悬液的鞘液流。
z 鞘液流和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷 嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相 交点称为测量区。
Population gating
Forward Scatter
细胞分选原理
z 在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使之产生同 频率的机械振动，流动室也随之振动，使通过测量区 的液柱断裂成一连串均匀的液滴。
z 各类细胞的特性信息在细胞形成液滴前在测量区已被 测定，并被储存在计算机中。
z 单某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞 仪就会在这类细胞形成液滴时给液滴充以特定电荷， 而不符合分选条件的含细胞液滴及不含细胞的空白液 滴则不被充电，即不带电荷。
可检测生物颗粒的理化性质包括细胞大小、形态、胞 浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完 整性和酶活性等。
在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、 遗传学、临床检验等学科广泛应用。
第一节 基本原理
发展历史
V 60至70年代是其飞速发展时期，激光技术、喷射技术 以及计算机的应用使流式细胞 仪在原理和结构上形成 了固定的模式。
z 通过区分荧光信号的宽度可确定荧光信号对应的 是单个细胞或多个细胞。
光谱重叠的校正：当采用两种以上荧光标记时，会因 为发射光谱的重叠造成检测误差。
z 使用荧光补偿电路，利用已知标准样品或荧光小 珠，可合理设置荧光信号的补偿值。
z 采用双激光立体光路技术，可减少各荧光间的相 互补偿。
4
z 细胞分析系统
z 染色的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。
1
z 荧光和光散射信号分别被呈90°角方向放置的PMT荧 光检测器和前向角放置的光电二极管散射光检测器接 收。
z 经过转换器转换为电子信号后，由模/数转换输入计 算机。
z 计算机通过相应的软件储存、计算、分析，可以得到 细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物 理和生化指标。
荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量， 主要用于对DNA倍体测量。
z 荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA的含量。
z 当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞得 到的荧光脉冲高度不等时，对荧光信号积分后， 所得到的信号值相等。
荧光信号的宽度：用于区分双连体细胞。
z 当两个G1期细胞粘连在一起时，测量到的DNA荧 光信号会与G2期细胞相等，造成检测误差。
z FCM测量数据的存贮、显示与分析
FCM数据存贮的方式均采用列表排队（List Mode） 方式，可实现多参数指标。
有数据显示、一维直方图、二维点图、等高线图、 密度图等多种显示方式。
通过分析软件可得到多种参数。
C-kit Receptor Expression On HPC Subsets
CD117
细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流 速与压力的关系服从贝努里（Bernouli）方程，即：
P = 1 pv2 2
只要压力恒定，即可得到恒定的鞘液流流速，从而 确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。
控制鞘液流速
调节采样分 析速度
2
由于激光焦点处能量分布为正态分布，中心处能量最 高。当检测分辨率要求较高时，一般应选择低速。
z 带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，根据 所带电荷的符号分别向左或右偏转，落入指定的收集 器内；不带电荷的液滴落入废液槽中。
流式细胞仪的基本结构
z 流动室及液流驱动系统 z 激光光源及光束形成系统 z 光学系统 z 信号检测与存贮、显示、
分析系统 z 细胞分析系统
z 流动室及液流驱动系统
流动室（Flow Chamber或Flow Cell）是FCM的核心 部件，被测样品在此与激光束相交。
V 进入90年代，随着微电子技术特别是计算机技术的 发展，流式细胞仪的功能也越来越强大。在数据管 理、数据分析方面有了长足进步。但是，在技术原 理和设计方面并没有突破性的进展。人们的注意力 开始转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、新的 荧光染料、新的染色方法不断推出，使流式细胞技 术在新的细胞参数分析方面日益发展
H L
A
D
r
CD117
CD38
CD117 CD117
5
Side Scatter
Forward Scatter
DNA Analysis
Forward Scatter Fluorescence
Forward Scatter
FALS
Fluorescence
FLUORESCENCE
Side Scatter