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可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman,Garnier,Cohen等 方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为 Cohen方法对转角的预测正确率很高,对于已知折叠类型的 蛋白质(αα类,ββ类,α/β类)正确率高达95%,对于未知结 构类型的蛋白质,可用3种类型分别预测,3类预测一致的转 角对预测表位有帮助。
抗原表位研究方法
1.传统化学“切割”法或酶法(classical epitope mapping)

通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片,再利用单克
隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段。
1.1 用化学法或酶“切割”抗原,分离抗原肽段
该法对蛋白质的一级结构不作要求,但测定结果只能是抗原的线性表位 。
一般情况下,一个多肽表位含5~6个氨基酸残基;一个多糖 表位含5~7个单糖;一个核酸半抗原的表位含6~8个核苷酸。
抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。
一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定,但其 中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用,这些残 基被称为免疫显性基团。
Hopp-Woods方案是以残基由有机相环境转移到水相环境的 自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性。现已明确,亲水性 部位与抗原表位并无很好的一致性,即高亲水性部位不一定 是表位,表位也不一定是亲水性部位。
B细胞抗原表位的预测法
(2)可及性方案(Accessibility) 如Janin可及性参数,指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分
2. 合成肽库方法
研究方法
肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合,它包括了该长度 的短肽的各种可能序列或其中的绝大部分。
2.1 有机合成法
有机合成法就是直接利用固相肽合成技术,合成含有各种可能序列的短 肽。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现,每个载体上只 含有一种序列的短肽。
优点是构建方法简单,迅速。缺点是不能扩增,筛选比较麻烦,需进行 荧光标记或ELISA,在显微镜下操作工作量比较大。
抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合, 从而激活淋巴细胞,引起免疫应答;抗原也借表位与相应抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。
抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。
C
抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合 A.抗原--抗体复合物的立体构象; B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开,可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生 在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间,两者呈现结构互补。 C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图
(5)电荷分布方案(Charge distribution)
认为对碱性抗原特异的抗体多趋于酸性,对酸性抗原特异的 抗体多趋于碱性。
抗原表位的预测法
(6)二级结构预测方案(Secondary structure) 认为β转角结构为凸出结构,多出现在蛋白质抗原表面,利
于与抗体嵌合,较可能成为抗原表位。而α螺旋、β片层结构 规则不易形变,较难嵌和抗体,一般不作为抗原表位。
Nozaki-Tanford scale,Eisenberg scale,Kyte-Doolittle scale,HPLC scale,Hopp-Woods scale
Hopp-Woods 方案认为:蛋白质抗原的氨基酸残基可分为疏 水性和亲水性两类。在机体内,疏水性残基一般埋在蛋白内 部,而亲水性残基位于表面,因此蛋白的亲水部位与蛋白抗 原表位有密切的联系。
利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、 玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。
研究方法
1.2 水解抗原-抗体复合物
这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法,又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原--抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水 解。
应用肽合成技术合成连续的重叠的5~7肽,将这些合成的肽 与相应的抗体反应,分析检测结果,以确定阳性反应片段。
这一技术要求有明确的抗原的一级结构,并且检测结果为抗 原线性表位。
该法应用广泛,已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生虫 蛋白、烟草花叶病毒(TMV)、Fy6蛋白、鸭肝炎B病毒(DHBV) 等。
用此法检测的抗原表位有人H铁蛋 白、蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等。
研究方法
3 缩氨酸扫描技术 (Peptide Scan technology)
此技术于1992年由R. Frank发展出来,它主要是将涵盖所有 抗原氨基酸序列的缩氨酸合成于固定的表面,并与抗血清标 定,此法可鉴定线性抗原表位。
在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法,通常从二肽 开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类,直至达到与抗体的最 大结合为止。
研究方法
2.2 基因工程法(噬菌体随机肽筛选法)
该法先利用基因克隆技术将合成的 一组寡核苷酸混合物(小肽基因混 合物)克隆至线性噬菌体基因组中, 使之以融合蛋白的形式在噬菌体的 外壳蛋白的氨基端表达。再利用生 物素或酶标记的抗体筛出特异的噬 菌体,并进行扩增,再筛选,从结 合特异抗体的噬菌体DNA序列推断 出氨基酸序列,并合成相应的短肽, 验证筛选结果。
从软件预测出的抗原表位须用实验来进一步验证。
B 细胞构象表位的预测
以往合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位,这无疑会遗漏众 多的构象性表位信息。近些年来,随着生物信息学和分子生物学 技术的飞速发展,采用计算机预测和试验相结合的方法进行构 象性表位分析和定位得到了迅速发展,一些可用的基于Web的 预测软件已经公布,如 CEP软件、DiscTope 软件和 MEPS软件。
抗原表位--分类
覆盖型和非覆盖型表位
某些抗原分子表面,不同表位之间相对分离,各自结合 特异性抗体,互不影响,这类表位被称为非覆盖型表位。
若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合, 此类表位称为覆盖型表位。
功能性和隐蔽表位
位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别,即具 有易接近性,可直接启动免疫应答,故称为功能性表位。
无需
天然的多肽、多糖、脂 多糖、有机化合物 5-15个氨基酸,5-7个 单糖或5-7个核苷酸
构象、线性表位
表位位置
抗原分子任意部位
抗原分子表面
研究意义
表位是蛋白质抗原性的基础 ,研究蛋白质抗原表位 , 对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型 疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。
应用:多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好 的特异性诊断试剂盒中更为重要。
后者又称构象型抗原表位,是由那些空间邻近但顺序上不连续 的氨基酸组成。
分类
按照与抗原受体细胞结合不同,分为B细胞抗原表位和T细 胞抗原表位。
特性
T细胞表位
B细胞表位
表位分子
TCR
BCR
MHC分子 表位性质 表位大小 表位类型
必需
主要是线性多肽 8-12氨基酸(CD8-TC) 12-17氨基酸(CD4-TC) 线性表位
存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能, 称为隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原,使其结构发生改变, 内部的隐蔽表位被暴露,可能成为新的有功能的表位。
分类
按表位结构不同,分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。
连续性表位又称线性表位,是由肽链上顺序连续的氨基酸组成 通常这种结合比较弱,因为小肽并不含完整天然蛋白的构象, 在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其 研究依赖于多肽固相化学合成技术。
子接触的可能性。它反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分 布情况。
抗原表位的预测法
(3)抗原性方案(Antigenicity)
对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基 酸统计分析,Welling建立了抗原性刻度。每个氨基酸用出现 在抗原区的频率描述,此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中 的频率就可推出此刻度值。
4 表位作图
研究方法
早期表位作图或定位(epitopemapping)是基于蛋白质修饰和 降解的原理,可经侧链化学修饰法选择性地标记氨基酸,失 去结合的部分将被测出。蛋白质抗原被降解为小片段,经测 序后确定抗体结合的位点。
要确定某一抗原的全部表位需要大量的时间。
现已可以通过诱变、蛋白质合成或蛋白竞争结合方法鉴定其 表位。此外,表位序列测定的应用对抗体结合表位的分析具 有显著的优越性。
该法研究表明,疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。 缺点是其所用的数据库有限,并且连续位点内的残基被认为
是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低 相关性。
抗原表位的预测法
(4)可塑性方案(Flexibility)
指蛋白抗原构象不是刚性不变的,其多肽链骨架有一定程度 的活动性,活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点,易形 成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知结构的31个蛋白质, 发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法。
5 抗原表位的预测法
研究方法
从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的 方法以来,已有许多参数、算法发表,对B细胞蛋白抗原表 位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预 测效果的方法,主要有以下6种:
抗原表位的预测法
(1)亲水性方案(Hydrophilicity)
化学切割法中常用的试剂:CNBr,NTCB,IBA,甲醇。 酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。 水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片
段分开,然后用Western blot,ELISA等各种检测手段来检测。结果可通 过理论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。
抗原表位的预测法
对上述各种参数的预测比较表明,各种方案预测的正确率均 不高。一般将上述多种方案综合考虑,尤以可及性方案、可 塑性方案、抗原性方案及二级结构预测为重要。
已经有一些文献提出了各自不同的综合分析方法。1988年 Jameson和Worf提出一种综合预测方案。权重选择为:40% 来自二级结构成分,可及性、柔韧性各15%,30%来自亲水 性。在吴加金等编的Goldkey软件中,以六种参数HoppWoods,HPLC,Accessibility,Flexibility,Charge, Antigenivity综合考虑,得出综合判断图,阈值以上的峰即认 为是预测的抗原表位。
根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。
对于蛋白酶水解位点较少的抗原,一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反 应,然后酶解,SDS-PAGE分离水解产物,分析结果。
对于蛋白酶水解位点较多的抗原,采用HPLC法,将抗原--抗体复合物的酶 解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰 高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。
研究方法--表位作图
推荐使用表位作图方法和基本条件
方法
构象表位
线性表位
条件
精确度
竞争分析方法 是,但并非经常 是
基因片段表达 法
是,但并非经常

合成肽库法 否

标记抗体、抗 仅确定空间位

置竞争
必须克隆, DNA(已知基因 序列)
构象50-200个 氨基酸 线状
10-20个来自百度文库基酸
必须建立肽库 完全绘制3-15
抗原表位的确立 与选择(一)
报告内容
1
概念
2
研究意义
3
研究方法
抗原表位--定义
抗原表位,又称抗原决定簇(antigenic determinant,AD),是 指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,因而表位代 表了抗原分子上的一个免疫活性区,负责与抗体分子或免疫 细胞表面的抗原受体结合。严格说来,抗体的特异性是针对 表位而不是针对完整的抗原分子的。
对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上,并将此固相 载体装柱,然后让过量的抗原溶液通过此柱,使抗原-抗体形成复合物。一 定条件下,酶溶液过柱,酶解此抗原-抗体复合物,PBS洗去酶解下的不结 合片段,再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段 以确定结果。
近来,质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地 确定了细胞色素C,胃泌素释放肽(GRP),脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原 表位。
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