食品微生物学检验菌落总数培训

—菌落形成单位的定义 —菌落总数的英文 —培养温度和时间
36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h
—微量移液器 —天平
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三 检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释 选择2～3个适宜样品匀液， 各取1mL分别加入无菌培养皿内
每皿中加入15mL～20mL 平板计数琼脂培养基，混匀 培 养 36℃±1℃ 48h±2h
• 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
• 称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告。
第二法 菌落总数PetrifilmTM测试片法
检验程序
• 除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM菌 落总数测试片外，其它与检验程序同第一 法。
操作步骤——样品的稀释
• 1:10的样品匀液制备后，用1mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH至6.6～7.2。 • 其他步骤同第一法
计数各平板菌落数 计算菌落总数 报 告
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第一法 平板菌落计数法
操作步骤——样品稀释
• 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀 释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min均 质1min～2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，
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培养基改变依据
• 国外食品微生物权威的检测方法如ISO、AOAC和 FDA/BAM等基本上都是采用平板计数琼脂或在平板 计数琼脂的基础上进行了改良；
• 针对能力验证菌落总数的样品，采用两种培养基，结 果无显著性差异； • 平板计数琼脂具有细菌比较容易生长，菌落特征明显 ，容易计数等特点。
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2、3MTM PetrifilmTM 细菌总数试片法
• 国外情况
– 比对试验数据（已发表） – 标准方法
• 国内情况
– 使用状况 – 比对试验数据（已发表）
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优缺点
• 优点： 1、培养基具有良好的生产质量； 2、菌落计数特别方便（容易判读），红色菌落，易于食品颗粒分开，也不菌落重叠现 象； 3、准确计数，有方格，尤其是数目较多时，两个人分别计数同一纸片时差异； 4、菌落分布特别均匀； 5、平行平板菌落结果一致性比较好，与避免了热损伤有关； 6、菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生； 7、安全方面不像玻璃平皿易碎、对人员造成潜在的伤害，另外密封比较好，不容易直 接接触菌落。 缺点： 1、某些有红色颗粒的样品，需要注意；粘稠的液体样品，不易分散开；表面活性比较 大，易流出等 2、颜色特别重的样品，如桔黄色，掩盖了菌落； 3、抑菌剂浓度比较高的样品，如辣椒及辣椒粉、大蒜及洋葱制品； 4、某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象，大部分是芽胞杆菌。
用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
• 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓
冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌 玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
操作步骤——样品稀释
• 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管 壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸 头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸
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二、修订的主要内容
——培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂 ——添加了PetrifilmTM 细菌总数检验测试片法 ——菌落计数公式进行了修改 ——添加了拍打式均质器或等效的设备 —— ………
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1、培养基改变情况
平板计数琼脂 （PCA) 胰蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖 琼 脂 蒸馏水 5.0g 2.5g 1.0g 15.0g 1000mL 营养琼脂（NA) 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼 脂 蒸馏水 10.0g 3.0g 5.0g 15.0g 1000mL
菌落计算－例子
1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度）38，35
C N
(n1 0.1n2 )d
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232 244 38 35 [2 (0.1 2)] 10 2 549 24909 2 2.2 10 25000
结果的表述——菌落总数的计算方法
• 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落 数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数 结果。 • 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。 • 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计 数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计 算。 • 若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘 以稀释倍数计算。 • 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以 最低稀释倍数计算。 • 若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小 于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
操作步骤——接种
• 根据对样本污染状况的估计，选择2～3个适宜稀 释度的样品匀液进行检验。将测试片置于平坦实 验台表面，揭开上层膜，用吸管或微量移液器吸 取1mL样品匀液，垂直滴加在测试片的中央，将 上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动 上层膜，将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中 央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养 膜上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1分钟 以使培养基凝固。每个稀释度接种两张测试片。
•
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菌落总数的卫生学意义
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修订依据（修订的主要参考方法）
• FDA/BAM Chapter 3 Aerobic Plate Count Jan. 2001
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SN 0168-92 出口食品平板菌落计数 AOAC 986.32 Aerobic Plate Count in Foods AOAC 988.18 Aerobic Plate Count AOAC 990.12 Aerobic Plate Count in Foods USDA/FSIS MLG CHAPTER 3 EXAMINATION OF FRESH, REFRIGERATED AND FROZEN PREPARED MEAT, POULTRY AND PASTEURIZED EGG PRODUCTS ISO 4833:1991 Microbiology -- General guidance for the enumeration of micro-organisms -- Colony count technique at 30 degrees C ISO 6610:1992 Milk and milk products-Enumeration Colony-forming units of micro-organisms-Colony-count technique at 30℃ NMKL APHA CCFRA JAPAN HPB
结果的表述
• 菌落总数的计算方法和报告规则同第一法。
谢 谢
3、菌落计算公式
有两个稀释度的菌落数在合适范围， 按照如下公式计算：
N
C
( n1 0.1n2 ) d
N = 样品中菌落数 ∑C =平板菌落数之和 n1 = 含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数 n =含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数 d = 第一稀释度（低）
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• 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的 菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培 养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述条件进 行培养。
菌落计数
• 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释 倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（ colony-forming units，cfu）表示。 • 选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板 计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于 300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用 两个平板的平均数。 • 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应 以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状 菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 • 平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，则应 将每条链（不同来源）作为一个菌落计。
操作步骤——培养
• 将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱 内。可堆叠至20片，培养温度和时间同第 一法。
操作步骤——计数
• 培养结束后立即计数,可肉眼观察计数，或用菌落计数器、 放大镜、PetrifilmTM自动判读仪计数。选取菌落数在30～ 300之间的测试片计数。 • 计数所有红色菌落。细菌浓度很高时，整个测试片会变成 红色或粉红色，将结果记录为“多不可计”。 • 有时，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌落，但 圆形培养膜的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多 不可计”；进一步稀释样品可获得准确的读数。 • 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象 。如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算 菌落浓度。
食品微生物学检验 菌落总数培训 （GB/T4789.2）
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内容
一、立项修订依据 二、主要修订内容 三、检验程序 四、第一法 五、第二法
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一 立项修订依据
• 修订的背景
– 标准清理 – 多年未进行修订
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修订的意义（紧迫性）
– WTO的要求 – 原标准的局限（培养基、计数方式等） – 3M纸片法
结果的表述——菌落总数的报告
• 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效
数字报告。
• 大于或等于100时，前第3Baidu Nhomakorabea数字采用“四舍五入”原则修约后 ，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指 数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有 效数字。
• 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
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统计学依据：
– 平板菌落数越多，结果越具有代表性； （不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等） – 取样量越大，结果越具有代表性； （同等取样条件、排除其他方面的干扰因素） 两个相邻的稀释度平板菌落数直接相加，不考虑 稀释倍数的影响，采用加权平均值代替简单的算 术平均值
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4、其他内容
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菌落计算公式
1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度）33，35
N C (n1 0.1n2 )d
232 244 33 35 544 24727 25000 2 2 [2 (0.1 2)]10 2.2 10
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C1 C2 n d1 n d 2 2 N 1 C1 10 C2 d1 n n 1 2
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2 232 244 380 350 4 10 2 1206 30150 30000 2 4 10
无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入2个无菌平
皿作空白对照。
• 及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养
基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿
，并转动平皿使其混合均匀。
操作步骤——培养
• 琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h 。水产品30℃±1℃培养72h±3h。
管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
• 按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀
释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
操作步骤——样品稀释
• 根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度 的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递 增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个