高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治疗前后肠道菌群变化

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中 国 微 生 态 学 杂 志 ２０１６ 年 ５ 月 第 ２８ 卷 第 ５ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌ，Ｍａｙ ２０１６，Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．５
种因素影响，包括分 娩 方 式、 喂 养 选 择 （母 乳 或 配 方 奶 ）、 早 产 、 抗 生 素 和 益 生 菌 的 使 用 等 ， 其 中 使 用 抗生素会改变肠道菌群的组成，对婴幼儿的健康成 长造成长远 的 不 良 影 响 。 ［５］ 为 了 观 察 婴 幼 儿 期 抗 生 素的使用对肠道菌群结构和多样性的影响，本研究 采用高通量测序技术对５例婴幼儿使用抗生素前后 的肠道菌群进行了１６ＳｒＲＮＡ 基因测序。
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＥＮＧ Ｙｕｅ－ｊｉｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｊｉｅｚ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｔｏｏｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ５ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｉｌｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｔｏ ｆｉｖｅ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎｓ Ｖ３ －Ｖ４ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６ＳｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｔｒｅａｔ－ ｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｔｏ ｆｉｖｅ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｂｕｔ ｔｈａｔ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ （Ｆ／Ｂ）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｍｏｓｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ， Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ，Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ， Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｄｏｒｅａ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ａｎｄ Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ５０％ ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ；Ｉｎｆａｎｔ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
１ 材 料 与 方 法
１．１ 一般资料 选择２０１３年９月至２０１４年３月在 深圳市儿童医院呼吸科住院的轻度社区获得性肺炎患 儿５例，男３例，女 ２ 例，年 龄 ２～８ 个 月。均 符 合 以 下 纳 入 标 准 ：（１） 根 据 临 床 表 现 及 影 像 学 检 查 ， 肺 炎的诊断及病情分度符合 《儿童社区获得性肺炎管理 指南 （２０１３修订）》［６－７］； （２）治疗前２周未接受任何 抗 生 素 和 微 生 态 制 剂 ；（３） 近 ２ 周 无 腹 泻 病 ， 入 院 时 大 便 常 规 检 查 正 常 ；（４） 无 心 、 肝 、 肾 、 内 分 泌 和 血 液 系 统 等 严 重 躯 体 疾 病 。５ 例 患 儿 的 抗 生 素 使 用 情 况 见表１，５例患儿在治疗过程中均无腹泻。
１．２ 粪 便 标 本 采 集 采 集 粪 便 标 本 两 个 时 间 点 分 别 为：（１） 未接受抗生素 治 疗 时； （２） 抗 生 素 治 疗 第 ３～５天。粪便分次收集，放于 粪 便 收 集 盒 中， 要 求 避免尿液、灰尘等污染，选取无污染的部分，粪便 标 本 量 大 于１ｇ。 标 本 采 集 后 标 记 患 儿 姓 名 ， 干 冰 运 送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通 量 测序。 １．３ 方 法 利 用Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 测 序 平 台 ， 对 细 菌 的１６ＳｒＲＮＡ 基因 Ｖ３～Ｖ４ 区 进 行 高 通 量 测 序， 并 对测序结果进行生物信息学分析。该过程委托上海 美吉生物医药科技有限公司进行。 １．３．１ 数 据 过 滤 及 ＯＴＵｓ （ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔｓ，操作 分 类 单 元 ） 获 取 将 测 序 得 到 的 ｒａｗ ｄａｔａ按照接头序 列 进 行 样 品 拆 分； 然 后， 将 包 含 超 过 １０ 个 低 质 量 值 的ｒｅａｄｓ、 接 头 污 染 序 列 超 过 １５ｂｐ 的ｒｅａｄｓ、 重 复 的ｒｅａｄｓ过 滤 掉 ， 获 得 高 质 量 的ｃｌｅａｎ ｄａｔａ并 完 成 数 据 过 滤 。
摘要：目的 了解抗生素对肺炎婴幼儿肠道菌群多样性和结构的影响。方法 选取５例１岁以内因轻度 社区获得性肺炎住院的患儿，收集抗生素治疗前及治疗后第３～５ 天 的 粪 便 标 本。 利 用Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ测 序平台，对细菌的 １６ＳｒＲＮＡ 基 因 Ｖ３～Ｖ４ 区 进 行 高 通 量 测 序， 并 对 测 序 结 果 进 行 生 物 信 息 学 分 析 。 结果 抗生素治疗后第３～５天婴幼儿肠道菌群的多样性明显下降。变形菌门的相对丰度在３例 婴 幼 儿 的 肠道中下降；厚壁菌门的相对丰度在４例婴幼儿的肠道中下降；而拟杆菌门的相对丰度在４例婴幼儿的 肠道中上升；厚壁菌门与拟杆菌门的比例下降。肠道内不动杆菌属、喜胆汁菌属、埃格特菌属、肠球菌 属、支原体、颤螺菌属、紫单胞菌属、普雷沃 菌 属 和 真 杆 菌 属 增 长 １ 倍 以 上； 奇 异 菌 属、 双 歧 杆 菌 属、 黄杆菌属、乳酸菌属、链球菌属、萨特菌属和韦荣球菌下降超过 ５０％。 结 论 婴 幼 儿 短 期 使 用 抗 生 素 治 疗肺炎后，肠道菌群的多样性下降，肠道微生态失衡。 关键词：肠道菌群；婴幼儿肺炎；抗生素 中图分类号：Ｒ３７８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５－３７６Ｘ （２０１６）０５－０４９７－０４ ＤＯＩ编 码 ：１０．１３３８１／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｍ．２０１６０５００１
Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔபைடு நூலகம் ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＨＵＡＮＧ Ｗｅｎ－ｘｉａｎ＊，ＷＡＮＧ Ｈｅ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｌｅｉ，ＤＡＩ Ｗｅｎ－ｋｕｉ，ＺＨＥＮＧ Ｙｕｅ－ｊｉｅ ＊Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ′ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１８０２６，Ｃｈｉｎａ
人体内定植的微生物与人类健康密不可分。人 体的肠 道 菌 群 （ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ） 具 有 以 下 重
基金项目：深圳市科技计划项目 （医疗卫生类）（２０１３０３０６８） 作者简介： 黄 文 献 （１９８２－）， 女， 硕 士， 主 治 医 师， 从 事 小
儿 呼 吸 感 染 临 床 工 作，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｗｅｎｘｉａｎ６ ＠１２６．ｃｏｍ 通信作者： 郑 跃 杰 （１９６３－）， 男， 博 士， 主 任 医 师， 从 事 小 儿 呼 吸 研 究 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｊｉｅｚ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
患儿
１ ２ ３ ４ ５
表 １ 患 儿 信 息 及 抗 生 素 使 用 情 况
性别 年龄 使用的抗生素 使用途径
男 ８个月 男 ２个月 女 ８个月 男 ２个月 女 ８个月
头孢呋辛 阿奇霉素 头孢呋辛 阿奇霉素 头孢呋辛
静脉注射 口服 静脉注射 口服 静脉注射
抗生素 使用时间
４天 ３天 ４天 ３天 ５天
中 国 微 生 态 学 杂 志 ２０１６ 年 ５ 月 第 ２８ 卷 第 ５ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌ，Ｍａｙ ２０１６，Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．５
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·论 著·
高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治疗前后肠道菌群变化
黄文献，王和平，王玉蕾，戴文魁，郑跃杰
深圳市儿童医院 呼吸内科，广东 深圳 ５１８０２６
通过 ｒｅａｄｓ 之 间 的 ｏｖｅｒｌａｐ 关 系 将 过 滤 后 的 ｒｅａｄｓ拼接成 Ｔａｇｓ， 并 在 ９７％ 相 似 度 下 利 用 ＵＳＥ－ ＡＲＣＨ （ｖ７．０．１０９０）［８］将其 聚 类 为 用 于 物 种 分 类 的
ＯＴＵｓ并获得初始 的 ＯＴＵｓ代 表 序 列； 然 后， 利 用 ＵＣＨＩＭＥ （ｖ４．２．４０）［９］将 ＰＣＲ 扩 增 产 生 的 嵌 合 体 从 ＯＴＵｓ代 表 序 列 中 去 除； 最 后， 使 用 ｕｓｅａｒｃｈ ＿ ｇｌｏｂａｌ将 所 有 Ｔａｇｓ比 对 回 ＯＴＵｓ代 表 序 列， 得 到 每个样品在最终的 ＯＴＵｓ代表序列 。 ［１０］ １．３．２ 物 种 注 释 分 析 利 用 此 前 得 到 ＯＴＵｓ代 表 序列，通过 ＲＤＰ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ （ｖ２．２） 软件将这些代表 序列与数据库 Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ （Ｖ２０１３０５）［１１］比 对 进 行 物 种注释，置信 度 阈 值 设 置 为 ０．８， 获 得 每 个 样 品 分 别在门、纲、目、科、属和种几个分类等级的相对 丰度情况，并 利 用 Ｒ 包 中 的 ｂａｒｐｌｏｔ获 得 各 自 的 柱 状图。从纲水平开始，将物种丰度在所有样品均低 于０．５％的物种合并为 Ｏｔｈｅｒｓ。 １．３．３ 物 种 多 样 性 （ａｌｐｈａ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ） 分 析 物 种 多样性 是 对 单 个 样 品 中 物 种 多 样 性 的 分 析， 其 中 Ｓｈａｎｎｏｎ指数以及 Ｓｉｍｐｓｏｎ 指 数 最 能 反 映 群 落 中 物 种丰 富 度 和 物 种 均 匀 度 。 ［１２］ 本 分 析 通 过 Ｍｏｔｈｕｒ （ｖ１．３１．２） 软件 计 ［１２］ 算 样 品 的 Ｓｈａｎｎｏｎ 和 Ｓｉｍｐｓｏｎ 值，然后采用 Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ对 组 间 的 物 种 多 样性 指 数 进 行 差 异 分 析 检 验， 并 通 过 Ｒ 软 件 （ｖ３．１．１） 绘制物种多样性指数的盒形图。 １．３．４ 统 计 学 分 析 抗 生 素 使 用 前 后 肠 道 菌 属 的 相 对丰 度 比 较 采 用 秩 和 检 验。Ｐ＜０．０５ 为 差 异 有 统 计 学意义。
要作用：参与肠道重要的代谢功能，阻止外来致病 菌在肠道黏膜的定植及刺激全身免疫系统和肠道黏 膜相 关 淋 巴 组 织 （ｇｕｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ， ＧＡＬＴ） 的 正 常 发 育 与 成 熟 。 ［１］ 近 年 来， 越 来 越 多 的研究表明肠道菌群与人类的疾病密切相关，对健 康产生重大影响 。 ［２－４］ 胎儿的肠道是无菌的， 出 生 后 肠道菌群逐渐形成，在２岁时肠道菌群的种类和数 量与成人水平相似。婴幼儿肠道菌群的建立受到多