流式细胞仪检测步骤4.15

流式细胞检测的步骤

【人乳腺癌贴壁细胞流式检测】

一、细胞铺板

1.调整细胞浓度

2.5×105，加2ml培养液于六孔板中置于培养箱中过夜，铺两板，次日加药,分别作用24h和48h。

2.分组设定：

调补偿组：空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组

实验组(FITC +PE组)：贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组

实验组中每组检测两次.

二、流式样品准备

1.消化：选取处于对数生长期的细胞，收集旧培养基，培养基离心。离心完毕后，离心管中剩2ml液体。用来贴壁细胞的终止消化。贴壁细胞用200ul 0.25%胰蛋白酶消化，消化5分钟，然后加2ml离心过的培养基终止消化。

2.离心：800r/min ,离心5min，弃掉上清液。

3.重悬：加2ml PBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。加300ulPBS重悬细胞。

4. 调补偿组：分别吸取贴壁细胞50ul细胞悬液于四个流式管中（此时细胞数至少为1×106/ml以上），分成四组，即空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO 组，FITC组，PE组。

实验组（(FITC +PE组): 贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组。实验组中每组检测两次，故每组分别吸取50ul细胞悬液于两个流式管中。

空白对照组什么也不加，剩下的每组加相应的抗体10ｕl。常温避光孵育20min。

5.孵育完成后，加1mlPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。

6.离心后垂直倒掉上清液,再加200ulPBS重悬细胞，进行上机检测。

三、操作注意

1.消化细胞时要让胰酶自然消化，最好不要人工拍打，否则会成片脱落，影响结果的测定。上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。

2.垂直倒掉上清液后，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。

3.上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光。

4.实验设置

空白对照组和贴壁细胞组加荧光染料前都是DMEM全培+贴壁细胞，只不过一个用于调补偿，一个用于实验检测。

贴壁细胞组姜黄素40 榄香烯50

DMSO组姜黄素40 榄香烯50

【人乳腺癌悬浮细胞流式检测】

一、细胞铺板

1.选取第三代处于对数生长期的悬浮球细胞，以密度3×105接种于低粘附6孔板中，铺两板，次日加药,分别作用24h和48h。

2.分组设定：

调补偿组：空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组

实验组(FITC +PE组)：悬浮细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组

实验组中每组检测两次

二、流式样品准备

1.消化：选取第三代处于对数生长期的悬浮细胞球，吸进15ml离心管中离心弃上清，再用0.05%胰蛋白酶消化，消化5min，然后加4mlPBS终止消化。

2.离心：800r/min ,离心5min,弃掉上清液

3重悬：加2ml PBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。加300ulPBS重悬细胞。

4. 调补偿组：分别吸取悬浮细胞50ul细胞悬液于四个流式管中（此时细胞数至少为1×106/ml以上），分成四组，即空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO 组，FITC组，PE组。

实验组（(FITC +PE组): 悬浮细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组。实验组中每组检测两次，故每组分别吸取50ul细胞悬液于两个流

式管中。

空白对照组什么也不加，剩下的每组加相应的抗体10ｕl。常温避光孵育20min。

5.孵育完成后，加1mlPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。

6.离心后垂直倒掉上清液，再加200ulPBS重悬细胞，进行上机检测。

三、操作注意

1.上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。

2.垂直倒掉上清液后，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。

3.上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光。

4. 空白对照组和悬浮细胞组加荧光染料前都是无血清培养基+悬浮细胞，只不过一个用于调补偿，一个用于实验检测。

悬浮细胞组姜黄素40 榄香烯50

DMSO组姜黄素40 榄香烯50