毒理学实验ppt

2、实验动物和饲养环境
• 首选健康成年白色家兔，其次为白色豚鼠。 • 至少需要4只健康成年动物（雄性和/或雌性均可）。
• 每只动物相邻的未处理的皮肤可作为对照。
• 每只单笼饲养，试验前动物要在实验室中适应3d。
• 常规饲料喂养，自由饮水
3、剂量设计
• 受试样品0.5ml(g)，均匀涂布于受试部 位。如受试样品难以获得，或易产生全身 毒性等原因，用量可适当减少。但为了试 验的一致性，测试面积应力求相等。
• 改良寇氏法：计算简便，准确率高，常用 • 霍恩法 • 序贯法 • Bliss法
改良寇氏法要求
• 每组动物数相等 • 百度文库剂量组组距呈等比级数
• 死亡呈正态分布
• 最低剂量组死亡<20%
• 最高剂量组死亡>80%
二、原理
• 健康动物按体重随机分组一次或多次 经口给药观察中毒特征或死亡剂量-反 应关系求出LD50 毒性分级
毒理学实验
实验一 实验动物的一般操作技术
一、目的 二、内容
（一）实验动物的选择
1、物种的选择：啮齿类、非啮齿类
基本原则：
① 代谢、生化、毒理学特征与人最接近的
② 自然寿命不太长的
③ 易于饲养和实验操作的 ④ 经济且易于获得的
2、品系的选择：遗传学控制分类
① 近交系：纯品系，经至少连续20代的全同胞兄妹之间或亲
3. 急性大失血法
7.空气栓塞法
8.化学药物致死法
4. 击打法
5. 麻醉致死法
9.开放性气胸法
微核实验动物染毒
• 阴性对照组：生理盐水 • 阳性对照组：环磷酰胺40-60mg/kg • 高剂量组：敌敌畏20mg/kg • 中剂量组：敌敌畏10mg/kg • 低剂量组：敌敌畏5mg/kg
实验二 急性经口毒性试验
④ 断头采血法
⑤ 家兔耳缘静脉采血法 ⑥ 心脏采血法
实验动物安全采血量
动物品种 最大安全采血量(ml) 最小致死采血量(ml) 小鼠 0.1 0.3
大鼠 豚鼠 家兔
1.0 5.0 10.0
2.0 10.0 40.0
2.尿液、粪便收集：代谢笼 （八）动物处死
1. 脊椎脱臼法 6.麻醉后急性放血法
2. 断头法
2. 经呼吸道染毒
① 静式吸入
② 动式吸入
③ 气管内注入
3. 经皮肤染毒
① 斑贴法（家兔）
被毛的去除：剪毛、拔毛、脱毛
② 浸尾法（大、小鼠）
4. 注射染毒：静脉注射、肌肉注射、腹腔注 射、皮下注射、皮内注射
（七）生物标本采集
1.血液采集：
① 大、小鼠鼠尾采血法
② 眼眶静脉丛采血法
③ 腹主动脉或股动(静)脉采血法
4、个体选择 ① 性别： ② 年龄：急性、慢性
以体重估计：组内、组间差异
③ 生理状态：雌--未产未孕，避免妊娠、激 素影响
④ 健康状况：健康动物
健康动物辨认：
健康动物辨认：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼 睛明亮，行动迅速、反应灵活，食欲及营养状况良好。 – (1)眼：明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。
三、材料与试剂
• 动物：昆明种小白鼠 • 器材：注射器、灌胃针、见到、镊子、试 剂瓶、标签笔、移液枪等（课下交还）
• 试剂：敌敌畏，苦味酸
四、步骤
1. 2. 3. 4. 5. 6. 动物选择 剂量设计：5-8个剂量（一般不设对照组） 动物称重、编号、标记 受试物配制 灌胃：0.1-0.2ml/10g体重 观察：急性毒性试验原始记录
急性毒性试验原始记录 受试物性状： 受试物来源： 染毒途径： 体重 （ g） 染毒量 （ml） 染 毒 时间 室温：
动物种属品系： 日期： 死 亡 时间 体重 记录
体征及出现时间
试验操作者：
实验记录者：
5. LD50计算：LD50及95%可信区间
敌敌畏小鼠经口染毒死亡情况 组别 1 2 3 4 5 i= ∑p= 剂量 mg/kg 对数 动物数 （n） 死亡数 (只) 死亡率 (p) 存活率 (q) p·q
– (2)耳，耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。
– (3)鼻：无喷嚏，无浆性粘液分泌物。 – (4)皮肤：无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。
– (5)颈部：要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不
应选作实验动物。 – (6)消化道：无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。
– (7)神经系统：无震颤、麻痹。若动物(大鼠、小鼠)出现圆圈动
尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或 粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行 解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。
(2)大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大 鼠比小鼠性情凶猛，不易用袭击方法抓取。 为避免咬伤，可带上帆布或棉纱手套。采 用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳， 余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中。
(3)豚鼠：豚鼠胆小易惊，在抓取时要稳、 准、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其 肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，另一 只手托住臀部即可。 (4)兔：用右手抓住兔颈部的毛皮提起，然 后左手托住其臀部或腹部，让其体重的大 部分重量集中在左手上。注意不要抓取双 耳或抓提腹部。
（四）实验动物称重、编号、标记
• 皮肤刺激性(Dermal Irritation)：皮 肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性 变化。 • 皮肤腐蚀性(Dermal Corrosion)：皮肤 涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损 伤。
试验的基本原则
• 将受试物一次(或多次)涂敷于受试动物的 皮肤上，在规定的时间间隔内，观察动物 皮肤局部刺激作用的程度并进行评分。 • 采用自身对照，以评价受试物对皮肤的刺 激作用。急性皮肤刺激性试验观察期限应 足以评价该作用的可逆性或不可逆性。
雌性豚鼠胸部有两个乳头。
（三）动物抓取 • 正确地抓取固定动物，既不损害动物健康、不影 响观察指标，又防止被动物咬伤 (1)小鼠：先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实 验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和 食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左 手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指 按住后腿即可。
• 对化妆品产品而言，可根据人的实际使用 和产品类型，延长或缩短敷用时间。 • 对用后冲洗的化妆品产品，仅采用2 h敷用 试验。 • 试验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残 留受试物。
• 如怀疑受试样品可能引起严重刺激或腐蚀 作用，可采用分段试验，将三个涂布受试 样品的纱布块同时或先后敷贴于一只家兔 背部脱毛区皮肤上，分别于涂敷后3min、 60min和4h取下一块纱布，皮肤涂敷部 位在任一时间点出现腐蚀作用，即可停止 试验。
代与子代之间交配培育而成的动物
② 杂交群：F1代，两个不同近交系之间进行有计划的交配.杂
交所产生的第一代动物，即F1代动物
③ 封闭群：5年内，随机交配。一个种群动物位于固定地
点，5年以上不从外部引进任何新种,仅在群内随机交配繁殖
遗传均一性：
一种毒物固定使用同种品系
3、微生物学和寄生虫控制的选择 Ⅰ级：普通动物，开放系统饲养 Ⅱ级：清洁动物，屏障系统饲养 Ⅲ级：SPF动动，屏障/隔离系统饲养 Ⅳ级：无菌动物，隔离系统饲养
项圈
耳缘孔口标记：
染色法：苦味酸、品红
耳缘孔口标记：
用耳号钳在耳上打洞或者用剪刀在耳边缘剪缺口，左耳为十位，右耳为个位。
（五）动物随机分组：随机数字表
（六）染毒途径和方法 1. 经口（胃肠道）染毒
① 喂饲：不易挥发、不易水解、无异味、不影响营养
② 吞咽胶囊： ③ 灌胃：灌前禁食空腹，不饮水，灌胃容积0.1～ 0.2ml/10g – 小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动 物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿 咽后壁徐徐插入食管。针插入时应无阻力，若感到阻 力或动物挣扎，应立即停止进针或将针拔出，以免损 伤或穿破食管及误入气管。
计算公式
• m=Xk-i(∑p-0.5)
pq Sm= i n
m：lgLD50 i:相邻两剂量组对数值的差 Xk：最大剂量的对数值 P：死亡率 q:存活率 n：每组动物数 ∑p=各剂量组死亡率总和
五、评价：毒性分级、毒性特征
六、讨论：
实验二 皮肤刺激性/腐蚀性试验 （豚鼠）
试验目的
• 确定化学物对哺乳动物皮肤局部是否有刺 激作用或腐蚀作用及其程度，为制定防护 化学物对皮肤的刺激保护措施提供依据。
• 敌敌畏原液浓度：1400mg/ml • 稀释成10mg/ml，81.53ml的母液 • 1400mg/ml*Vx=10mg/ml*81.53ml Vx=0.582ml V水=81.53-0.582 第1组 20ml 第2组 剩余母液+20ml水→混匀后取20ml 以此类推
受试物名称： 动物来源及合格证号： 剂量组别 动 物 （mg/kg） 编号 性 别
剂量设计：
• 预实验：文献LD50=50-92mg/kg
• 设置400、200、100、50、25mg/kg 五个剂量，每剂量3只鼠。 • 找出LD100和LD0 • 组距i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1） • n是实验组数；i是正式实验中两个相邻剂量 组的剂量对数之差
• A: lg200=2.301 • B: lgx=2.301-i • C: lgy=2.301-2i • D: lgz=2.301-3i • E: lgw=2.301-4i • F: lg50=1.690
表1 皮肤刺激反应评分 皮 肤 反 应
红斑和焦痂形成 无红斑 轻微红斑（仅仅可觉察到） 明显红斑 中等程度到重度程度红斑 严重红斑（轻微的结痂）至轻度焦痂（深度损伤） 水肿形成 无水肿 很轻微水肿（仅仅可觉察到） 轻微水肿（肿起部位边界清楚） 中度水肿（隆起约 lmm） 严重水肿（隆起约 lmm，超出染毒部位）
• 强酸或强碱物质如pH≤2或pH≥11.5， 由于可预见其腐蚀特性，不必做本试验；
• 若已知受试样品有很强的经皮吸收毒性 （LD50≤200mg/kg bw）的物质不必 进行本试验；
试验方法
1、受试样品 • 液态受试样品采用原液或人类实际应用浓度 • 固体受试样品经研磨，过100目筛后用水或 适当的赋形剂（如凡士林、阿拉伯树胶、乙 醇和水、羧甲基纤维素、聚乙二醇、丙三醇、 植物油和矿物油等）按一定比例调制，以保 证与皮肤充分接触。
一、目的
• 掌握LD50 计算方法和急性毒性分级标准
• 熟悉经口灌胃技术
• 了解急性毒性试验的设计原则
急性毒性、急性毒性分级标准
• 急性毒性：一次或多次接触，短时间产生 的毒性效应，包括一般行为和外观改变， 大体形态改变以及死亡效应等。 • 农药的急性毒性分级：低、中、高、剧毒
LD50计算方法
4、试验步骤
1）试验前准备 • 试验前24h，将实验动物脊柱两侧毛剪去 或剃掉，不可损伤表皮，去毛范围左右各 3cm×3cm。24h后，选择皮肤健康完整 无损的动物进行试验。不应在长有浓密岛 状毛的部位进行受试样品试验。
2） 染毒
• 受试样品0.5ml(g)直接涂布在皮肤上， 用二层纱布（2.5cm×2.5cm）和一层玻 璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和 绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采 用封闭试验，敷用时间为4h。
3）观察期限
• 观察时间的确定应足以观察到可逆和不可逆刺激 作用的全过程，一般不超过14d。
• 于清除受试样品后的1、24、48、72h分别观 察给予受试样品部位的皮肤反应，按表1进行皮 肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合 评价，根据24、48和72h各观察时点最高积分 均值，按表2判定皮肤刺激强度。
1：k系列稀释法
• 最大剂量组浓度C1 （母液浓度） C1=200mg/kg=2mg/10g 0.2ml/10g→2mg/0.2ml=10mg/ml
• 每组最大体积m=20ml（设每只鼠需2ml）
• k：相邻两组剂量之比=64.89/85.981=0.75
• V总=m/（1-k）=81.53ml（各组母液和）
作或提尾倒置呈圆圈摆应放弃该动物。 – (8)四肢及尾：四肢、趾及尾无红肿及溃疡。
（二）动物性别鉴定
• (1)大鼠、小鼠：主要依肛门与生殖孔间的距离
区分，间距大者为雄性，小者为雌性。成年雄鼠
卧位可见到辜丸，雌性在腹部可见乳头。 • (2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠颈部，另一只手扒 开靠生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性 器官的突起，雌性动物则显示三角形间隙，成年