基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
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ZHU Shao-jun1 ，LI Yan-Hong2 ，ZHANG Wei1 ，WANG Xu-Xia3 ， GONG Li1 ，LI Ai-Ning1 ，LAN Miao1
1
Department of PathoIogy，2 Department of Obstetrics and Gyne-
coIogy， 3 Department of GastroenteroIogy， Tangdu HospitaI， Fourth MiIitary MedicaI University，Xi an 710038 ，China 【 Abstract 】 AIM： To estabIish a way to detect the gene rearrangements of IgH and TCR and to assess the appIication of the detection technigue in the diagnosis of maIignant Iymphoma. METHODS：Fifty-three cases of maIignant Iymphoma and 20 cases of reactive Iymphoid hyperpIasia were chosen for making tissue sections. Genomic DNA was extracted，and ampIified via PCR. The products were resoIved on denaturing poIyacryIamide geIs and visuaIized through siIver staining. RESULTS： Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 20 cases of reactive Iymphoid hyperpIasia. In aII of 18 cases of T ceII-nonHodgkin s Iymphoma（ T-NHL ） ，gene rearrangement of TCR ! was found in 12 cases and that of TCR " was found in 3 cases， and IgH gene rearrangement was not found. IgH gene rearrangement was found in 28 cases out of 32 cases of B ceII-NHL（ BNHL） ，in 2 cases of which gene rearrangements of TCR ! and IgH were both found. There was IgH gene rearrangement in 3 cases of suspected Iymphomas. There was a remarkabIe difference between NHL group and benign group in gene rearrangment（ P < 0. 05 ） . CONCLUSION：The detection of gene rearrangements of IgH and TCR by PCR can be a kind of subsidiary means to diagnose the IymphoproIiferative disease. ParticuIarIy， the cIonaIity showed in the formaIin-fixed and paraffin-embedded sampIes may be usefuI in the retrospective researches. 【 Keywords 】Iymphoma；gene rearrangement；poIymerase chain reaction；neopIasm
［ 1］ 发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排 . 因此，
对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性 疾病的诊断. 此研究拟应用这一手段， 探讨淋巴组织 增生性病变的性质， 并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊 断价值进行探讨.
收稿日期： 2005-12-30 ； 接受日期： 2006-03-06 基金项目： 国家自然科学基金 （ 30171052 ） ； 国家回国人员研究启动基 金 （ Hg98004 ） ； 陕西省卫生厅科研基金 （ 02D02 ） 通讯作者： 张 伟. TeI： （ 029 ） 84777467 EmaiI： zhwIyh@ fmmu. edu. cn 作者简介： 朱少君. 硕士. TeI： （ 029 ） 84777744 Fax： （ 029 ） 83552079 EmaiI： zhushaojun1977@ 126. com
提取基因组 DNA. 引物合成 引物序列由上海生工生物工程技
1. 2. 2
术公司 合 成. 引 物 序 列 为：p -球 蛋 白 基 因 内 对 照 PC03 ： ACACAACTGTGTTCACTAGC ， PC04 ： CAACTTCATCCACGTTCACC ； 免疫球蛋白基因重排 （ IgH ） FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT， LJH： TGAGGAGACGGTGACC ，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG； T 细胞受体基因重排 （ TCR p 链和 v 链） Db1 ： CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC ， Jb2 ：AGCACTGTGAGCCTGGTGCC ， T VG ： AGGGTTGTGTTGGAATCAGG， T J ： CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC ，V v11 ：TCTGGAGTCTATTACTGTGC ，V v101 ：CTCACACTCTCACTTC ， J v12 ： CAAGTGTTGTTCCACTGCC ，Jp12 ：GTTACTATGAGCTAGTCC. 1. 2. 3 PCR 扩增及循环条件 PCR 扩增在 PT-200 型热循环仪 （ MJ ReSearch ） 上进行. 反 应 体 系 为 25 含 10 mmoI / L dNTP （ Gibco BRL）2 卜L， 10 X 缓冲 卜L， 液 2. 5 卜L， 50 mmoI / L MgCI2 0. 75 卜L， !"# DNA 聚合 酶 （ Gibco BRL）1 U， 20 pmoI / L 引物 1 卜L， DNA 样品 1 ~ 5 卜L. IgH 基因采用半巢氏 PCR 扩增：第一轮引 物为 FR3A 和 LJH，95C 预变性 3 min，然后 94C 变 性 40 S，62C 退火 50 S，72C 延伸 40 S，共 30 个循 环；最后 72C 延伸 10 min. 扩增产物经 11100 稀释后 取 1 卜L 进行 第 二 轮 扩 增，引 物 为 FR3A 和 VLJH， 95C 预变性 3 min，然后 94C 变性 40 S， 60C 退火 50 S， 72C 延伸 40 S，共 30 个循环；最后 72C 延伸 10 min. FR 3A 与 VLJH 扩增产物为 100 ~ 120 bp. TCRp 和 TCRv 采用 40 个循环，其中 TCRv 引物 为 V v11 ， V v101 和 J v12 或 V v11 ， V v101 和 Jp12 的 混 合 物.
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1. 1
材料和方法
材料 53 例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医
大学唐都医院病理科 （ 1995 ~ 2005 ） . 其中男性 29 例
第四军医大学学报 （ J Fourth MiI Med Univ） 2006 ； 27 （ 9 ） http： / / journaI. fmmu. edu. cn
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第四军医大学学报 （ J Fourth MiI Med Univ） 2006 ； 27 （ 9 ） http： / 源自文库 journaI. fmmu. edu. cn
・研究原著・
文章编号： 1000-2790 （ 2006 ） 09-0776-05
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
朱少君1 ， 李艳红2 ， 张 伟1 ， 王旭霞3 ， 巩
777
（ 55% ） ， 女性 24 例 （ 45% ） ； 年龄 12 ~ 76 岁， 平均年 龄 44. 2 岁. 所有标本均为福尔马林固定、 石蜡包埋 组织. 其中 B 细胞非何杰金淋巴瘤 32 例， T 细胞非 未能定性的淋巴组织增生性病 何杰金淋巴瘤 18 例， 变 3 例. 20 例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴 性对照. 所有淋巴瘤病例均在取 PCR 模板前经临床 病理 HE 和免疫组化标记 （ B 细胞：CD20 ， CD79 a；T 细胞：CD3 ， CD45RO ） 证实， 以确定为相应病例且所 取部位确为病变部位， 包含有需检测的部分. 3 例未 能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为 B-NHL （ 免疫 组化标记 CD79 a 阳性） ，但诊断仍未明确. ! . "# 方法 1. 2. 1 石蜡包埋组织 DNA 的提取 每例标本制备 厚度为 4 卜m 的切片 6 张， 贴于载玻片上， 常规烤片、 二甲苯脱蜡、 乙醇冲洗， 切片自然干燥. 用无菌双面 刀片将组织刮入 1. 5 mL 的离心管中， 按以前的 方 法
［ 2 - 3］
56C 退火 50 95C 预变性 3 min，然后 94C 变性 40 S， S， 72C 延伸 40 S； 最后 72C 延伸 10 min. TCRp 扩增 产物为 65 ~ 85 bp. TCRv 各组扩增产物在 70 ~ 200 bp 不等. p -球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠，共 40 个循环. 95C 预变性 3 min， 然后 94C 变性 40 S， 60C 退火 50 S， 72C 延伸 40 S； 最后 72C 延伸 10 min. 产 物长度为 110 bp. 1. 2. 4 电泳及结果观察 琼脂糖凝胶 （ 20 g / L） 电泳 评价扩增效果后， 将 3 卜L 产物和等体积的上样缓冲 ［ 4］ 液 （ 990 mL / L 甲酰胺， 1 g / L 溴酚蓝， 1 g / L 二甲苯 青） 混匀后加到厚度为 0. 8 mm 的聚丙烯酰胺凝胶 （ 100 g / L， 含尿素 8 moI / L） ， 应用 miniVE 系统 （ AmerSham-Pharmacia Biotech ） 泳动 8 h （ 80 V ） . 取出后按
【 摘 要】目的：建立基于克隆性分析技术的 B 和 T 淋巴细 胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术， 探讨 B 淋巴细胞 免疫球蛋白及 T 淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊 断中的应用. 方法：从组织蜡块中切取组织片 5 ~ 10 张， 提取 PCR 扩增， 聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基 基因组 DNA， 因重排结果. 结果： 20 例良性淋巴组织反应性增生病例中， 淋巴细胞 IgH 及 TCR 基因重排均为阴性； 18 例 T 细胞非何杰 未 金氏淋巴瘤中 TCR! 基因重排 12 例，TCR" 基因重排 3 例， 见有 IgH 基因重排； 32 例 B 细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中 有 2 例 TCR! 和 IgH 基因重排均 有 28 例 IgH 基因重排阳性， 阳性； 3 例未确诊的疑难病例均为 IgH 基因重排； IgH 及 TCR 基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间， 差异有显著意义 （ P < 0. 05 ） . 结论：应用 PCR 法检测 B 淋巴细胞 IgH 和 T 淋 巴细胞 TCR 基因重排可作为淋巴细胞来源的良、 恶性病变的 一种辅助诊断手段， 且适用于石蜡标本以进行回顾性研究. 【 关键词】淋巴瘤； 基因重排； 聚合酶链反应； 肿瘤 【 文献标识码】A 【 中图号】R733. 4
［ 2］ 以前 的 方 法 银 染， 分 别 用 UVP 凝 胶 分 析 系 统
（ UVP，Cambridge， UK ） 和 光 学 照 相 记 录 数 据， 根据 IgH 及 TCR 相应阳性位置判断结果. 1. 2. 5 结果判定 阳性结果判定标准： ① PCR 扩增 电泳条带清晰， 宽度不大于 1 mm， 边缘锐利； ② 片段
0
引言
恶性淋巴瘤 （ maIignant Iymphoma ） 是免疫系统的
原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏 病 （ Hodgkin s disease，HD ） 及非何杰金恶 性 淋 巴 瘤 ， 淋巴瘤的 （ non-Hodgkin s maIignant Iymphoma ，NHL） 诊断一直是病理诊断中的难点， 部分淋巴组织增生性 病变单纯通过 HE 和免疫组化很难明确性质， 另外 NHL 由于种类繁多， 分类复杂， 给临床病理工作者带 来了一定的困难. 淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗 原受体 （ Ig 和 TCR） 基因通过基因重排而形成有功能 的基因. 一个 T， B 细胞或其克隆性后代， 均只含一种 独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞
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丽1 ， 李爱宁1 ， 兰
淼1
（ 第四军医大学唐都医院： 病理科， 妇产科， 消化科， 陕西 西安 710038 ）
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Detection and clinical significance of gene rearrangements in diagnosis of lymphomas
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Department of PathoIogy，2 Department of Obstetrics and Gyne-
coIogy， 3 Department of GastroenteroIogy， Tangdu HospitaI， Fourth MiIitary MedicaI University，Xi an 710038 ，China 【 Abstract 】 AIM： To estabIish a way to detect the gene rearrangements of IgH and TCR and to assess the appIication of the detection technigue in the diagnosis of maIignant Iymphoma. METHODS：Fifty-three cases of maIignant Iymphoma and 20 cases of reactive Iymphoid hyperpIasia were chosen for making tissue sections. Genomic DNA was extracted，and ampIified via PCR. The products were resoIved on denaturing poIyacryIamide geIs and visuaIized through siIver staining. RESULTS： Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 20 cases of reactive Iymphoid hyperpIasia. In aII of 18 cases of T ceII-nonHodgkin s Iymphoma（ T-NHL ） ，gene rearrangement of TCR ! was found in 12 cases and that of TCR " was found in 3 cases， and IgH gene rearrangement was not found. IgH gene rearrangement was found in 28 cases out of 32 cases of B ceII-NHL（ BNHL） ，in 2 cases of which gene rearrangements of TCR ! and IgH were both found. There was IgH gene rearrangement in 3 cases of suspected Iymphomas. There was a remarkabIe difference between NHL group and benign group in gene rearrangment（ P < 0. 05 ） . CONCLUSION：The detection of gene rearrangements of IgH and TCR by PCR can be a kind of subsidiary means to diagnose the IymphoproIiferative disease. ParticuIarIy， the cIonaIity showed in the formaIin-fixed and paraffin-embedded sampIes may be usefuI in the retrospective researches. 【 Keywords 】Iymphoma；gene rearrangement；poIymerase chain reaction；neopIasm
［ 1］ 发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排 . 因此，
对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性 疾病的诊断. 此研究拟应用这一手段， 探讨淋巴组织 增生性病变的性质， 并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊 断价值进行探讨.
收稿日期： 2005-12-30 ； 接受日期： 2006-03-06 基金项目： 国家自然科学基金 （ 30171052 ） ； 国家回国人员研究启动基 金 （ Hg98004 ） ； 陕西省卫生厅科研基金 （ 02D02 ） 通讯作者： 张 伟. TeI： （ 029 ） 84777467 EmaiI： zhwIyh@ fmmu. edu. cn 作者简介： 朱少君. 硕士. TeI： （ 029 ） 84777744 Fax： （ 029 ） 83552079 EmaiI： zhushaojun1977@ 126. com
提取基因组 DNA. 引物合成 引物序列由上海生工生物工程技
1. 2. 2
术公司 合 成. 引 物 序 列 为：p -球 蛋 白 基 因 内 对 照 PC03 ： ACACAACTGTGTTCACTAGC ， PC04 ： CAACTTCATCCACGTTCACC ； 免疫球蛋白基因重排 （ IgH ） FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT， LJH： TGAGGAGACGGTGACC ，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG； T 细胞受体基因重排 （ TCR p 链和 v 链） Db1 ： CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC ， Jb2 ：AGCACTGTGAGCCTGGTGCC ， T VG ： AGGGTTGTGTTGGAATCAGG， T J ： CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC ，V v11 ：TCTGGAGTCTATTACTGTGC ，V v101 ：CTCACACTCTCACTTC ， J v12 ： CAAGTGTTGTTCCACTGCC ，Jp12 ：GTTACTATGAGCTAGTCC. 1. 2. 3 PCR 扩增及循环条件 PCR 扩增在 PT-200 型热循环仪 （ MJ ReSearch ） 上进行. 反 应 体 系 为 25 含 10 mmoI / L dNTP （ Gibco BRL）2 卜L， 10 X 缓冲 卜L， 液 2. 5 卜L， 50 mmoI / L MgCI2 0. 75 卜L， !"# DNA 聚合 酶 （ Gibco BRL）1 U， 20 pmoI / L 引物 1 卜L， DNA 样品 1 ~ 5 卜L. IgH 基因采用半巢氏 PCR 扩增：第一轮引 物为 FR3A 和 LJH，95C 预变性 3 min，然后 94C 变 性 40 S，62C 退火 50 S，72C 延伸 40 S，共 30 个循 环；最后 72C 延伸 10 min. 扩增产物经 11100 稀释后 取 1 卜L 进行 第 二 轮 扩 增，引 物 为 FR3A 和 VLJH， 95C 预变性 3 min，然后 94C 变性 40 S， 60C 退火 50 S， 72C 延伸 40 S，共 30 个循环；最后 72C 延伸 10 min. FR 3A 与 VLJH 扩增产物为 100 ~ 120 bp. TCRp 和 TCRv 采用 40 个循环，其中 TCRv 引物 为 V v11 ， V v101 和 J v12 或 V v11 ， V v101 和 Jp12 的 混 合 物.
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材料和方法
材料 53 例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医
大学唐都医院病理科 （ 1995 ~ 2005 ） . 其中男性 29 例
第四军医大学学报 （ J Fourth MiI Med Univ） 2006 ； 27 （ 9 ） http： / / journaI. fmmu. edu. cn
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第四军医大学学报 （ J Fourth MiI Med Univ） 2006 ； 27 （ 9 ） http： / 源自文库 journaI. fmmu. edu. cn
・研究原著・
文章编号： 1000-2790 （ 2006 ） 09-0776-05
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
朱少君1 ， 李艳红2 ， 张 伟1 ， 王旭霞3 ， 巩
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（ 55% ） ， 女性 24 例 （ 45% ） ； 年龄 12 ~ 76 岁， 平均年 龄 44. 2 岁. 所有标本均为福尔马林固定、 石蜡包埋 组织. 其中 B 细胞非何杰金淋巴瘤 32 例， T 细胞非 未能定性的淋巴组织增生性病 何杰金淋巴瘤 18 例， 变 3 例. 20 例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴 性对照. 所有淋巴瘤病例均在取 PCR 模板前经临床 病理 HE 和免疫组化标记 （ B 细胞：CD20 ， CD79 a；T 细胞：CD3 ， CD45RO ） 证实， 以确定为相应病例且所 取部位确为病变部位， 包含有需检测的部分. 3 例未 能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为 B-NHL （ 免疫 组化标记 CD79 a 阳性） ，但诊断仍未明确. ! . "# 方法 1. 2. 1 石蜡包埋组织 DNA 的提取 每例标本制备 厚度为 4 卜m 的切片 6 张， 贴于载玻片上， 常规烤片、 二甲苯脱蜡、 乙醇冲洗， 切片自然干燥. 用无菌双面 刀片将组织刮入 1. 5 mL 的离心管中， 按以前的 方 法
［ 2 - 3］
56C 退火 50 95C 预变性 3 min，然后 94C 变性 40 S， S， 72C 延伸 40 S； 最后 72C 延伸 10 min. TCRp 扩增 产物为 65 ~ 85 bp. TCRv 各组扩增产物在 70 ~ 200 bp 不等. p -球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠，共 40 个循环. 95C 预变性 3 min， 然后 94C 变性 40 S， 60C 退火 50 S， 72C 延伸 40 S； 最后 72C 延伸 10 min. 产 物长度为 110 bp. 1. 2. 4 电泳及结果观察 琼脂糖凝胶 （ 20 g / L） 电泳 评价扩增效果后， 将 3 卜L 产物和等体积的上样缓冲 ［ 4］ 液 （ 990 mL / L 甲酰胺， 1 g / L 溴酚蓝， 1 g / L 二甲苯 青） 混匀后加到厚度为 0. 8 mm 的聚丙烯酰胺凝胶 （ 100 g / L， 含尿素 8 moI / L） ， 应用 miniVE 系统 （ AmerSham-Pharmacia Biotech ） 泳动 8 h （ 80 V ） . 取出后按
【 摘 要】目的：建立基于克隆性分析技术的 B 和 T 淋巴细 胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术， 探讨 B 淋巴细胞 免疫球蛋白及 T 淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊 断中的应用. 方法：从组织蜡块中切取组织片 5 ~ 10 张， 提取 PCR 扩增， 聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基 基因组 DNA， 因重排结果. 结果： 20 例良性淋巴组织反应性增生病例中， 淋巴细胞 IgH 及 TCR 基因重排均为阴性； 18 例 T 细胞非何杰 未 金氏淋巴瘤中 TCR! 基因重排 12 例，TCR" 基因重排 3 例， 见有 IgH 基因重排； 32 例 B 细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中 有 2 例 TCR! 和 IgH 基因重排均 有 28 例 IgH 基因重排阳性， 阳性； 3 例未确诊的疑难病例均为 IgH 基因重排； IgH 及 TCR 基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间， 差异有显著意义 （ P < 0. 05 ） . 结论：应用 PCR 法检测 B 淋巴细胞 IgH 和 T 淋 巴细胞 TCR 基因重排可作为淋巴细胞来源的良、 恶性病变的 一种辅助诊断手段， 且适用于石蜡标本以进行回顾性研究. 【 关键词】淋巴瘤； 基因重排； 聚合酶链反应； 肿瘤 【 文献标识码】A 【 中图号】R733. 4
［ 2］ 以前 的 方 法 银 染， 分 别 用 UVP 凝 胶 分 析 系 统
（ UVP，Cambridge， UK ） 和 光 学 照 相 记 录 数 据， 根据 IgH 及 TCR 相应阳性位置判断结果. 1. 2. 5 结果判定 阳性结果判定标准： ① PCR 扩增 电泳条带清晰， 宽度不大于 1 mm， 边缘锐利； ② 片段
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恶性淋巴瘤 （ maIignant Iymphoma ） 是免疫系统的
原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏 病 （ Hodgkin s disease，HD ） 及非何杰金恶 性 淋 巴 瘤 ， 淋巴瘤的 （ non-Hodgkin s maIignant Iymphoma ，NHL） 诊断一直是病理诊断中的难点， 部分淋巴组织增生性 病变单纯通过 HE 和免疫组化很难明确性质， 另外 NHL 由于种类繁多， 分类复杂， 给临床病理工作者带 来了一定的困难. 淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗 原受体 （ Ig 和 TCR） 基因通过基因重排而形成有功能 的基因. 一个 T， B 细胞或其克隆性后代， 均只含一种 独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞
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Detection and clinical significance of gene rearrangements in diagnosis of lymphomas