甲型肝炎病毒抗体检测方法的比较及初步应用

摘要：甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒引起的急性肠道传染病。甲型肝炎的发展在我国不但是一个重要的公共卫生问题，也是一个值得关注的社会问题，目前，专家们通过对甲型肝炎的特异抗体的检测来寻求适用于甲型肝炎的早期诊断方法。本文简要介绍二种测定甲型肝炎病毒抗体的检测方法并且对这两种方法进行了比较及初步的应用，这两种方法分别是：固相放射免疫测定法检测甲型肝炎病毒LgM抗体和斑点金免疫渗滤试验快速检测抗体甲型肝炎LgM抗体，比较了不同方法检测的敏感性和特异性，以其为甲型肝炎病毒的早期诊断提供借鉴和依据。
关键词：甲型肝炎；检测；LgM抗体?
前言
近年来，我国由于生活水平的提高人们对于自身身体健康越来越注重。我们围绕甲型肝炎做了以下实验，因为甲型肝炎在我国不但是一个重要的公共卫生问题，也是一个值得关注的社会问题。甲型肝炎抗体是针对甲肝的一种特异性抗体。甲型肝炎病毒圆球形颗粒，无包膜，核心为单链正股RNA，属小RNA病毒科嗜肝病毒属。甲型肝炎病毒的传播途径主要是手、口病。病毒在患者血清ALT升高前的5～6天就存在于患者的血液和粪便中，我们可以通过对患者血液和粪便的检测发现甲型肝炎病毒，从而进行隔离治疗。甲型肝炎病毒有极大的调查意义。比如在某一机构群体中发现甲型肝炎后，收集这一群体的粪便送检，能及早发现潜伏的甲型肝炎病毒，从而尽早隔离，切断传染源。甲型肝炎病毒的检测在食品检疫、追踪传染源等有极大的研究意义，如对流行区河海口水源及贝壳类食品检疫可及早确定传染源，防止疾病的发生。因此灵敏度高，特异性强，操作简单的固相放射免疫测定法和斑点金免疫渗滤试验法，就很适合甲型肝炎的早期诊断和流行病学研究。
第一部分：固相放射免疫测定法检测甲型肝炎病毒LgM抗体
固相放射免疫测定法是在稀释待检血清中加入一颗已包裹山羊抗人LgM抗体的聚乙烯小珠，经孵育后，血清血中含有的甲肝LgM抗体，与小珠上的抗人LgM抗体结合，形成抗原抗体复合物。形成抗LgM抗体和甲肝LgM-甲肝抗原复合物。如果加入了125碘标记的甲肝抗体就会形成了一个抗LgM抗体和甲肝LgM-甲肝抗原125碘标记的甲肝抗体的复合物。在做这个实验检测前我们先要制备出很纯的抗原和抗体以免因为其它物质而影响了整个实验的结果。
一、材料与方法
1.1材料与标准来源
本试验所用的山羊抗人LGM抗体包裹小珠，125碘标记的甲型肝炎病毒抗体甲型肝炎病毒抗原阳性对照 、阴性对照、标本稀释剂等试液均为国家供应的HAVAB-M，实验标本来自梧州市疾病与防预控

制中心血清标本共165份。
1.2操作方法
1. 先准备好所用的器材、药品、做好实验前的清洁工作。
2.稀释血清标本，稀释待检血清中加入每管加入等量的放射性标记抗原和一定量的抗体用移液器吸20微升血清，再取3毫升生理盐水，将血清作1：200倍稀释。3.加入稀释液200微升震荡3分钟。
4.吸取稀释待检血清10微升放在小井中待测。
5.加入一颗山羊抗人LGM抗体的小珠，并分为3份阳性对照及2份阴性对照。
，震荡3分钟，在室内孵育2.5个小时。
6.每颗小珠用蒸馏水3-5毫升洗3次。
7.加入山羊抗人LgM抗体溶液，震荡3分钟，在室温孵育。
8.先用蒸馏水洗3次然后再加入200微升125碘标记的山羊抗人LgM抗体，震荡3-5分钟，45度的水浴孵育4个小时。
9.先用蒸馏水洗 3次吸干，然后再把小珠移入计算管，置γ射线闪烁计数器上计数1分钟。
10.在做实验中我们都应该注意保障用药的准确，实验台的干净度，器材的正确用法法。
2、结果
本实验要求阳性对照平均值与阴性对照平均值之比最少大于6倍才能有效。
判断值（Cutoff Value)=(阳性对照的平均值/10）+阳性对照平均值，观察记录检测标本脉冲数是否在在判断值的+10%范围内。
我们使用国家供应的HAVAB-M药盒，按上面介绍的实验做法，对梧州市疾病与防预控制中心的165例血清标本进行了甲型肝炎病毒特异性LgM抗体的检测，对其特异性、流行、诊断病学等做了深度的研究，结果见表2-1。
表2-1 165例各种人群检测甲肝IgM抗体及
乙型肝炎实验表明抗原（HBsAg）后果
临床诊断 检查例数 甲肝IgM阳性 HBsAG阳性 甲肝IgM+HBsAg阳性
例数（%） 例数（%） 例数（%）
急性黄痘型
病毒性肝炎 53 38（53.6） 12（27.9） 3（18.5）
急性无黄痘型
病毒性肝炎 29 0 29（100）
迁延肝炎 14 0 14（100.0）
慢性肝炎 12 3（10.0） 9（89.0）
慢性重症肝炎 8 0 8（100.0）
HBsAg携带者 15 0 11（80.7） 4（13.3）
供血员 30 0 0
合 计 165 41 83 7
3、讨论
本实验研究表明，急性黄痘型病毒性肝炎占的个数比较高，其中急性黄痘型病毒性肝炎中甲肝阳性例数占30.4%， HBsAG阳性例数占27.9%，两者都有的有的占18.5%，一共占总数的37.8%。急性无黄痘型病毒性肝炎、迁延肝炎、慢性重症肝炎只显示HBsAG阳性。慢性肝炎中甲肝阳性例数占10.0%，HBsAG阳性例数占89.0%。HBsAg携带者中HBsAG阳性例数占80.7%，两者都有的有的占13.,3%。供血员中没有检查出有甲肝抗体。从以上数据表明了在甲型肝炎病患者在感染了甲型病毒后出现了三种特异性抗了分别是甲肝IgM阳性、HBsAG阳性和甲肝IgM加HBsAg阳性。由本实验操作结果可知甲肝炎病毒的早期

比较容易检测得出，进一步说明甲型肝炎病毒容易被检测出来。在甲型肝炎病毒感染的中期中只出现了甲肝HBsAG阳性表示到了甲型肝炎病毒的急性期。慢性肝炎中只有3例中有甲肝抗体，经过一番调查得知这种病例在入院临床时检测为慢性乙型肝炎，HBsAG为阳性，表现为急性期。正常人中各类特异性抗体都正常，不可能没有这种抗体。
前言
免疫斑点试验(DotImmunobindingAssay,DIBA)是以硝酸纤维膜为载体，用抗人μ链包被，通过渗滤作用，与血清中的IgM抗体结合，再加甲肝抗原和金标显色剂，阳性结果有红色斑点出现。可以用微孔膜抗原作为载体，经过滤和浓缩后的抗原抗体反应迅速，阳性反应出现在胶片黑斑上。该方法不仅保持了酶联免疫吸附试验和放射免疫分析的灵敏度和特异性，而且具有快速、特异的特点。HAAg易受温度影响，造成其活性下降，甚至失活。因为HAAg的这一特点，造成了胶体金保存时间不长。而DIGFA通过将HAAg固相在硝酸微孔膜滤上，解决了这一问题。同时因为胶体金本身具有肉眼可见的红色，DIGFA法的操作时间就大大的缩小了，且操作步骤也简单许多，几分钟就可以完成了整个实验，也不需要特别的机器。
第二部分：斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎LGM抗体
甲型肝炎病毒特异性坛M抗体(HAV)是甲型肝炎初期诊断的特异性血清学标记。本实验中，深色胶体金标记抗体检测指标，可以用微孔膜抗原作为载体，经过滤和浓缩后的抗原抗体反应迅速，阳性反应出现在胶片黑斑上，整个反应约需3- 4 min。免疫胶体金标记技术就形成了斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)而且
获得了比较好的结果。
1材料和方法
?甲型肝炎病毒抗原(HAAg)，为细胞培养抗原，我们一部分购于医院的试剂厂，一部分是本单位自己动手制备。?氯金酸是国家化工厂的产品，批号为9 3199。?羊抗人IgM抗体购于梧州市人民医院免疫室。④抗人u链单克隆抗体本单位自己动手制备。⑤血清标本，甲肝病人血清一部分由梧州市儿童医院提供。流行性出血热病人血清由本单位提供;其它血清标本来自梧州市医院人民医院免疫室。⑥DIGFA检测试剂盒:购于北京贝尔生物工程有限公司。
1. 2方法
1. 2 1准备好所用的器材、药品、做好实验前的清洁工作。
1.2.2先将测定血清中加入有HAAg的微孔滤膜上，在膜上形成肉眼可见深色斑点.
1.2.3胶体金制备取 0. 05％ 氯金酸100 ml加热到沸，加入现成的柠檬酸钠1.8m1.继续煮沸约10 min，溶液就会变成了深色胶体金溶液，胶体就制备完成了。
1.2.4抗人μ链抗体胶体用金溶液2m和 l0. 1mol/L zC03混和调至pH分别到10. 0, 9. 0和7. 5。加入抗人LgM抗体溶液，血清蛋白

浓度液离心5 min，取上清液离心20 min,弃上清得出液体。
1.2.5用硝酸纤维素薄膜膜用三蒸水浸泡置用洗涤液震洗1～2次，滤纸吸干
↓再37℃温箱中干燥20～30分钟，然后打圆片。，用钠盐（BSA）封闭，然后，使用磷酸盐缓冲盐水溶液，洗涤10分钟干燥，最后加载到自制的免疫过滤装置的板上。
1.2.6将免疫渗滤板取出编出对应的数字，在1号膜中央点一滴0.01 mol /L PBS，等渗入膜内后，
1.2.7在做实验中我们都应该注意保障用药的准确，实验台的干净度，器材的正确用法法。
2结果
本次实验用DIGFA法检测血清标本共279份，结果显示阳性100份,阴性179份。现在还没有明确规定用什么办法来做为标准所以我们选用了ELISA法作为参照标准来确定其他方法的特异度和灵敏度。所以经过计算，DIGFA法的特异度为98％，灵敏度为97％。说明DIGFA法有很好的特异性和灵敏性。
通过阻断试验与2-ME破坏试验，无论是用HAAg和抗人Ig M阻断作用后，再做DIGFA，还是用2-ME处理后做DIGFA，阳性IgM抗-HAV血清都全部转为阴性.。实验证明DIGFA法检测的确是Ig M抗一HAV 。
操作容易出现的错误：1在做这个实验时不能有粗心大意之心，所有试剂溶液必须准确到克或者豪升。2所用到的水或纸必须干净，不能带有其它物质，会影响到最终结果。3用完的工具要及时清理，保持桌面清洁，用完的东西要及时归位。4
3讨论
正确的实验操作是实验成功的基本条件，因此在实验中就需要时刻注意。实验前检测标本尽量避免反复冻融、溶血或长菌，否则可能影响检测结果。 DIGFA检测试剂盒的不同批号、不同品种试剂不能混用；严格控制反应时间和反应温度，使用常见抗凝剂，如枸橼酸钠、肝素、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠等，抗凝后的血浆标本与血清标本的试验结果没有区别。
HAAg易受温度影响，造成其活性下降，甚至失活。因为HAAg的这一特点，造成了胶体金保存时间不长。而DIGFA通过将HAAg固相在硝酸微孔膜滤上，解决了这一问题。同时因为胶体金本身具有肉眼可见的红色，DIGFA法的操作时间就大大的缩小了，且操作步骤也简单许多。
在DIGFA中血清和酶标抗体是分开加入的，所以它们之间不存在竞争抑制关系，而是直接的固相抗体捕获。该试验方法仅适用于甲型肝炎的早期诊断和研究，对甲型肝炎病毒的进一步研究就需要同时结合患者的临床体症或进一步结合其它方法来进行。

4二种甲型肝炎病毒抗体检测的比较
通过以上实验可以比较得出，固相放射免疫测定法检测甲型肝炎病毒LgM抗体可示知血清中是否存在甲型肝炎病毒特异性LgM抗体，固相放射免疫测定法中LgM

抗体检测是最有用的一种。固相放射免疫测定法操作简单、易懂、实验结果比较容易显示、应用比较广泛。
斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎LgM抗体是近年来发展起来的免疫检测新技术，有快速渗滤及毛细管作用，可以用微孔膜抗原作为载体，经过滤和浓缩后的抗原抗体反应迅速，阳性反应出现在胶片黑斑上。该方法不仅保持了酶联免疫吸附试验和放射免疫分析的灵敏度和特异性，而且具有快速、特异的特点。
固相放射免疫测定法检测甲型肝炎病毒LgM抗体实验操做比较简单,斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎LgM抗体比较快。两者共同的特点有：1、比较准确的检测得出甲型肝炎病毒LgM抗体；2、检测得出的结比较快；3、实验操做比较简单一学就会；4、两者对实验操作都比较严格。