Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术
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半定量RT-PCR步骤
步骤： 1.抽提RNA，2.反转录获得cDNA，3.以cDNA 为模板做PCR
注意： 步骤1，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内 参的选择，常用的有βactin和GAPDH两种。步骤3，半 定量RT-PCR应该在两管中进行，既内参和目的基因各一 管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 指数期和平台期一定要摸清楚！
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T百度文库qMan探针法
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TaqMan探针法
TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普 通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团 采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不 产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有 MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针 的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针 可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得 探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的 情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB 探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
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SYBR Green I荧光染料技术
SYBR Green I荧光染料能 与所有的DNA双链相结合， 对DNA模板没有选择性，所 以特异性不如TaqMan探针。 要想用荧光染料法得到比较好 的定量结果，对PCR引物设计 的特异性和PCR反应的质量要 求就比较高。在此前提下，本 法是一种成本低廉的选择。
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TaqMan探针法
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的 5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探 针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记 有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随 着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信 号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
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常规PCR仪
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实时定量PCR仪
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TaqMan探针法
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SYBR Green I荧光染料技术
SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一 种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表 了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量 PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染 料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时， SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚 合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成 后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统 检测到荧光的净增量加大。
半定量RT-PCR原理
半定量RT-PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后，扩 增目标cDNA和内参cDNA，通过PCR产物量推测样品中特 异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的DNA序列，其 表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标 基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样 扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目 标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：βactin（β肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等
半定量RT-PCR步骤
步骤： 1.抽提RNA，2.反转录获得cDNA，3.以cDNA 为模板做PCR
注意： 步骤1，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内 参的选择，常用的有βactin和GAPDH两种。步骤3，半 定量RT-PCR应该在两管中进行，既内参和目的基因各一 管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 指数期和平台期一定要摸清楚！
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T百度文库qMan探针法
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TaqMan探针法
TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普 通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团 采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不 产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有 MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针 的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针 可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得 探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的 情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB 探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
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SYBR Green I荧光染料技术
SYBR Green I荧光染料能 与所有的DNA双链相结合， 对DNA模板没有选择性，所 以特异性不如TaqMan探针。 要想用荧光染料法得到比较好 的定量结果，对PCR引物设计 的特异性和PCR反应的质量要 求就比较高。在此前提下，本 法是一种成本低廉的选择。
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TaqMan探针法
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的 5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探 针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记 有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随 着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信 号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
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常规PCR仪
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SYBR Green I荧光染料技术
SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一 种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表 了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量 PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染 料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时， SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚 合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成 后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统 检测到荧光的净增量加大。
半定量RT-PCR原理
半定量RT-PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后，扩 增目标cDNA和内参cDNA，通过PCR产物量推测样品中特 异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的DNA序列，其 表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标 基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样 扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目 标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：βactin（β肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等