种子的扩大培养

3，确定种子罐级数需注意的问题
（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会 （2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 （3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐 的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也 可相应地减少种子罐的级数。
一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程
斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时 培养基特点：菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸， 并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体， 培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮 而不含或少含糖为原则。 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
种子Biblioteka Baidu扩大培养
种子扩大培养的目的与要求 种子制备的技术概要 种子制备实例
第一节
种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念:
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷 冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试 管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 罐逐级扩大培养 ,最终获得一定数量和质量 的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
4、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 P 147
5、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式： 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁 殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作 简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不 强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养 法。
（一）孢子的制备
1，细菌孢子的制备
细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培 养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产 芽孢的细菌培养则需要5~10天。
2，霉菌孢子的制备
霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等 天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养 时间一般为4~14天。
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度 质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH 酶活等 无污染
影响种子质量的因素及控制
孢子的质量 培养基 培养条件 种龄 接种量
种子培养基要满足的要求
（1）营养成分适合种子培养的需要 （2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； （3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用； （4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素 含量要高 （5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
2，培养条件
（1）温度 （2）通气量 (3) 湿度
第三节 种子制备过程举例
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安培管
→ 斜面孢子 → 大米孢子
→ 二级种子 → 发酵
→ 一级种子
一、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
二、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
种龄：12h，pH值：6.4±0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查：(-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。 一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基 组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于 长菌考虑。所使用的原料已经基本接近于发酵培养基
3，放线菌孢子的制备
放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为 5~14天。
（二）液体种子制备
1，好氧培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐
种子扩培的目的

接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
第二节 种子制备的技术
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验
室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
2，厌氧培养
对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的 制备过程如下： 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
二、生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至种子 罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌 种而异，但其原则为采用易被菌利用的成 分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是 需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气， 并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均 匀分布，获得相同的培养条件。
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨
目的：长菌体
4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
1 种子罐的作用
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝） 体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的 菌体量，以利于产物的合成。
种子罐级数
是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取 决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖 速度； （2）所采用发酵罐的容积。
种子罐级数的确定
细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少， 二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发 芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（27℃，10~24小 时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一 级种子