转座子相关技术在微生物功能基因组研究中的应用

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转座子介导的报告基因融合技术
转座子可以随机插入 <’= 片 段 中 ， 利用这一特性可将之用
于在目的基因和转座子内部整合的报 告 基 因 之 间 产 生 随 机 转 录
2?］ ， 它 与翻译融合蛋白。 最早被使用的报告基因是 !"#$ 和 %&’(［2>，
们分别可产生 !@半乳糖苷酶活性及碱性磷酸酶活性，从而可以 利用颜色作为指示剂来进行定量分析。随后， 一些其他的报告基 因， 如绿色荧光蛋白基因、 虫荧光霉素基因， 也分别被用于转座 子介导的基因融合技术。
［83%-"#2-］ NGC34O94934 CG8 J9F6>8 ?83856< 8>8J8354 5=C5 <C3 G8>9<C58 :G9J 938 ?839J6< >9<C5693 59 C395=8GP
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已知， 因此为目前正在进行的炭疽杆菌中 突 变 基 因 的 克 隆 、 测序 和定位分析打下了基础， 有望发现新的芽孢形成相关基因。 越来越多的实例表明，转座子 诱 变 技 术 是 一 种 成 熟 的 基 因 功能研究技术，目前已广泛地应用于 微 生 物 功 能 基 因 组 的 研 究 中。虽然该方法还存在着工作量大等问题， 但随着技术的不断完 善， 它必将对基因功能的研究起巨大的推动作用。
目前， 应用转座子诱变技术已经对 枯 草 芽 孢 杆 菌 、 胎儿弯曲 菌、 大肠杆菌、 嗜血流感菌、 幽门螺杆菌、 产单核细胞李斯特菌、 脑膜炎奈瑟菌、 普通变形杆菌、 铜绿假单胞菌 、 鼠伤寒杆菌、 肺炎 链球菌、 小肠结肠炎耶尔森菌和酿酒酵母 进 行 了 研 究 分 析 ， 并找 将含有 到 了 许 多 功 能 未 知 和 已 知 的 基 因 。 %"") 年 ， XCGIC3 等［#］ 得到近 % +"" N3>;: 的质粒 OENY) 转入产单核细胞李斯特菌中， 个突变体克隆， 从这些克隆中筛选到 !1 个 对 盐 及 碱 压 力 敏 感 的 突变体， 并从中发现了 ’ 个新的与盐及碱压力有关的基因。本文
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综
述
转座子相关技术在微生物功能基因组研究中的应用
王玉飞， 王恒樑， 黄留玉
军事医学科学院 生物工程研究所， 病原微生物生物安全国家重点实验室， 北京 !""",! ［摘要］ 转座子是 -./ 插入因子的一种， 是指能在基因组间或组内跳跃的 -./ 片段。转座子作为插入突变剂或分子标签 已被广泛地应用于基因的分离和克隆， 且因其独特的性质已成为发现新基因和基因功能分析的有效工具。这使得转座子无 论是在单基因水平还是全基因组水平， 都成为细菌、 酵母和其他微生物研究的有力工具。简单而有效的体外转座反应可以 对一些以往难以进行分析的顽固微生物进行转座诱变分析。而建立在转座子基础上的信号标签诱变技术和遗传足迹法的 应用则发现了一些新的病原微生物毒力因子， 从而可以更好地对这些病原微生物的致病机理进行阐述。这些再次说明转座 子是微生物功能基因组研究中的有力工具。本文综述了转座子及其衍生载体介导的一些技术， 并讨论其在微生物功能基因 组研究中的应用。 ［关键词］ 转座子； 诱变； 微生物功能基因组学 ［中图分类号］ 0,1# ［文献标识码］ /
2?C 。碱性磷酸酶的氨基端 首先介绍 %&’( 和 #A@%&’( 系统 B24，
部分序列对其表达酶活性是非必需的， 当缺少氨基端 （除 信 号 肽 碱性磷酸酶融合蛋白仍能显示同 以外） 达 24 个 氨 基 酸 残 基 时 ， 酶 野生型相同的酶活性；但当 4D 个或更 多 氨 基 端 残 基 缺 失 时 ， 活性则明显下降。碱性磷酸酶的这一 特 征 对 构 建 融 合 蛋 白 非 常 有用， 常被设计用于研究通过细胞膜的蛋白质的分泌。 #A@%&’( 是 转 座 子 #A) 的 衍 生 物 ， 它 含 有 无 信 号 肽 序 列 的 碱 性 磷 酸 酶 （图 2= ） 。 当它随机插入染色体 <’= 时， 如果 %&’( 基因的一部分 有缺陷的 %&’( 的羧基端肽段融合到目的蛋白的氨基端肽段 上 ， 结果可产 生 融 并在目的基因和 %&’( 之间产生正确的阅读框架， 合蛋白； 同时， 靶基因编码细胞膜表面蛋白所需的转移信号， 可 将羧基端的 %&’( 片段转移到细胞周间隙 （图 2( ） 。因此， 这些融 合蛋白能显示碱 性 磷 酸 酶 活 性 。 #A@%&’( 融 合 在 研 究 基 因 功 能 方面有许多应用： " 检测蛋白的表达并定 位 蛋 白 ； #通 过 随 机 插 入染色体 <’= ，有可能找到新的编码跨膜蛋白或细胞周间质蛋 白的基因； $ 此类活性融合蛋白融合 接 头 的 位 置 能 帮 助 确 定 膜 蛋白朝向细胞周间质的基因区。 #670/E 等 B2;C通过 %&’( 突 变 研 究 证实，霍乱弧菌所有的细菌毒性因子 蛋 白 均 为 细 胞 外 或 细 胞 周 间质蛋白。 *F/GH/IJ 等 B23C用 4 个 #A@%&’( 融 合 突 变 寻 找 到 一 个 至少 22 JK 的染色体区， 是 )24D 霍乱弧菌多糖成 分 （荚 膜 和 )9 抗原） 表 达 所 必 需 的 。 ,/0LKMEN 等 B2OC 将 #A@%&’( 随 机 插 入 )24D 霍乱弧菌染色体 <’= ， 在含 ?@ 溴 @>@ 氯 @4@ 吲哚磷酸的低铁营养 琼脂上筛选蓝色的 %&’( 阳性表型克隆子， 从 4:: 株上述 菌 落 中 这些突变株的蓝色表型被含铁 得到 9? 株 #A@%&’( 插入突变株， 片抑制。 其中一株突变株为 #A@%&’( 插入霍乱弧菌 )4D? 和 *+,( 基因，这一基因受铁调节并影响细菌 的 毒 性 ， 此 突 变 株 命 名 为 它 在 乳 鼠 的 !<?: 值 比 其 出 发 菌 株 )4D? 高 9 个 数 量 级 。 5(,>: ， 发展了一种有效的方法， 可构建人工转座 2DD> 年 %I/HH 等［93］ 子， 并在体外将它插入到靶质粒中， 以便进行 <’= 的测序。该方 法几乎可将任何 <’= 序列或重组 序 列 转 入 人 工 转 座 子 中 ， 然后 使用酵母 #7. 类病毒颗粒的整合 酶 活 性 ， 将 这 种 转 座 子 插 入 到 靶质粒中去。由于插入是一个随机的过程， 因而产生插入的多样 性， 这一特性使其成为基因测序的有力工具。人工转座子测序法 属于随机测序法，其特点是测序无特 定 方 向 性 ， 而 是 随 机 对 靶 最后通过计算机拼装而得到完整的序列信息。 当 <’= 进行测序， 导入转座子以后，首先利用转座子所 携 带 的 抗 性 标 记 来 筛 选 阳 性克隆，然后可以使用转座子两端的 特 异 序 列 作 为 测 序 引 物 来 对阳性克隆进行测序。这样可以得到一系列重叠的序列片段， 最
［9*: ;’"+%］ 5GC34O9493W J75C?838464W J6<G9F6C> :73<5693C> ?839J6<4 转座子是 -./ 插入因子的 一 种 ， 是指能在基因组间或组内 跳 跃 的 -./ 片 段 ， !#+! 年 ;CGFCGC K<>6359<S 首 先 在 玉 米 中 发
［!］ 。 之后， 许多转座子在各种 现， 后来被命名为转座元件或转座子
均可用此法分离鉴定，这对于那些已 知 表 型 而 未 知 其 基 因 调 控 机制的微生物遗传学研究尤为有利。 目 前 用 于 该 技 术 的 转 座 子 、 、 、 、 、 、 有 细 菌 转 座 子 N38［*］ N39［+］ N3:［’］ N3;<［,］ N399=［1］ N3>;:［#］
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的情况下监控启动子控制的 !"#$ 基因的表达情况，可以推测该 启动子相关的正负调控。如果能够对 !"#$ 基因融合进行合理恰 当的设计和分析， 可以获得非常精细、 重要的信息。%0MLQMGJR 等 B9?C 将 #A-./ @!"#$ 转 座 子 转 入 化 脓 链 球 菌 染 色 体 中 来 获 得 随 机 的 （4:S 和 43S ） 、 不同的生 !"#$ 转录融合。他们通过在不同的温度 长时期以及不同种血清 （人血清、 兔血清、 马血清和鼠血清） 的诱 从 导 情 况 下 分 别 监 控 相 应 启 动 子 控 制 的 !"#$ 基 因 的 表 达 情 况 ， 而获取有关启动子的信息。 近年来人们还设计了很多含可 调 控 启 动 子 的 人 工 转 座 子 元 件， 这样当转座发生于启动子区域和基因 的 起 始 密 码 子 区 域 时 ， 基因的转录便从自然状态转到可调控 状 态 ， 从 而 可 以 较 容 易 地 诱导或抑制基因表达。作为指示系统 的 转 座 子 报 告 基 因 融 合 系 统在检测基因表达、 研究细菌基因功能方 面 有 重 要 作 用 ， 是一个 值得深入研究的领域。
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［收稿日期］ %""+$!"$!* ［作者简介］王玉飞 （!#,1$ ） ， 女， 硕士研究生 ［通讯作者］王恒樑， （U$JC6> ） TC3?=>Z36<PFJ6PC<P<3
而现在转座子诱变技术已经成为微生 物 功 能 基 因 组 研 究 的 有 力 工具之一。该技术包括 ) 个步骤： ! 将转 座 子 插 入 靶 基 因 ； "筛 选感兴趣的突变体， 并证实该突变是由转 座 子 插 入 引 起 的 ； #确 定并克隆靶基因。用此方法分离基因 的 好 处 在 于 不 需 要 鉴 定 待 测基因的产物，只要转座因子插入可 引 起 表 型 发 生 变 化 的 基 因
!
转座子诱变技术
最初， 体外转座技术的开展只是为了方便研究转座机制
［%， )］
，
作者所在实验室也成功地将含有 N3>;: 的质粒 OENY) 转入炭疽 并从中筛选到 ’ 个芽孢形 杆菌， 得到了近 % """ 个突变体克隆， 成缺陷型突变体。由于炭疽杆菌和 N3>;: 的 全 部 基 因 序 列 均 为
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［!"］ ［!!］ ［!%］ ， 以及噬菌体 K7 和酵母转座子 N@; 等。 2B>;;
原核与真核生物中陆续被发现， 因此认为它是普遍存在的。在微 生物中， 不管是对单个基因还是对全基因 组 来 讲 ， 均可利用转座 子作为插入突变剂或分子标记来进行 相 关 研 究 ， 遗 传 操 作 的 简 便性使其成为分子遗传学研究的有力工具之一。近年来， 利用转 座子及其衍生载体发展了一系列技术 ， 本 文 简 述 某 些 重 要 的 转 座子相关技术在微生物功能基因组研究中的应用进展。