胆固醇测定实验讲义

实验12 直接皂化-比色法测定鸡蛋中胆固醇含量
一、原理
当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合反应，产生颜色物质。

因此可先对食品样品进行皂化和提取，用磷硫铁试剂作为显色剂，测定食品中胆固醇的含量。

在样品的冰乙酸提取液中加磷硫铁试剂，胆固醇与试剂反应产生紫红色化合物，颜色的深浅与胆固醇的量成正比，可用分光光度计在波长560nm•处测定。

二、实验仪器及试材
1.仪器：分光光度计、水浴锅
2.试剂：本实验用水均需用蒸馏水或去离子水。

试剂纯度均为分析纯。

（1）石油醚（沸点30-60℃）、无水乙醇、冰乙酸。

（2）50%氢氧化钾溶液：称取50g氢氧化钾，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。

（3）25%氯化钠溶液：称取25g氯化钠，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。

（4）10% 三氯化铁溶液：将10g FeCl3·6 H2O溶于磷酸中，定容至100 mL，储于棕色瓶中，冷藏保存。

（5）磷硫铁试剂：取10% 三氯化铁溶液1.5mL于100mL棕色容量瓶内，加浓硫酸定容至刻度。

（6）胆固醇标准储液：准确称取胆固醇100mg，溶于冰乙酸中，定容至100mL。

（7）胆固醇标准溶液：临用前将储液用冰乙酸稀释10倍。

三、实验方法与步骤
1.样品胆固醇提取
准确称取充分混匀的鸡蛋约0.20g于25mL具塞比色管中，加入0.5mL50%氢氧化钾溶液和4.5mL无水乙醇，振荡混匀，在80℃恒温水浴中皂化20min。

皂化时每隔5min振摇一次使皂化完全。

皂化完毕，取出比色管，冷却。

加入10mL 石油醚，盖紧玻璃塞，振摇1min，静置分层。

取上层石油醚液1mL，置于25mL具塞比色管内，在65℃水浴中让石油醚自然挥发干，加入4mL冰乙酸，轻摇使胆固醇溶解，待测。

2.样品和标准胆固醇含量测定
另取两支25mL具塞比色管，一支（空白管）加入4mL冰乙酸，一支（标准管）加入1mL胆固醇标准溶液（0.1mg/mL）和3mL冰乙酸。

包括样品管，各管分别加入2mL磷硫铁试剂，混匀，25℃放置20min后在560nm波长下比色。

以空白管调零，测得吸光度。

四、计算
鸡蛋胆固醇（mg/100g）= A
样/A
标╳
0.025mg/mL╳4mL╳10mL/1mL╳100/M
样
g
= A样/A标╳100/M样（mg/100g）五、实验注意事项
浓硫酸、强碱溶液具有腐蚀性，小心操作。

六、思考题：
1.举例说明胆固醇测定的其它方法。

2.实验中样品皂化的作用是什么？。