酵母菌筛选的方案

第一部分：酵母筛选收集

一．土样中酵母的分离：

1．土壤的采集处理

采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。

将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。

2. 土壤中菌种的分离：

称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。

为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。

观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。

二．葡萄果表酵母的分离:

1. 葡萄的采集：

葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。

2. 菌种分离步骤：

将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。

随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制

成菌悬液，吸取50µl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。

然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。

为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。

观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。

三. 自然发酵过程中酵母菌的分离:

将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。

称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。

取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。

为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。

观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。

四. 设备表面酵母的分离：

取擦拭过设备表面的棉球，将其中的菌液挤出，取1 m菌液经梯度稀释法结合划线分离得到单菌落。以上菌液通过梯度稀释法进行划线分离单菌落：无菌条件下取1 ml含菌的样品处理液→用无菌的生理盐水稀释为若干梯度（10-1-10-7）→将稀释液涂布于固体培养基平板，28 ℃培养3d→菌落计数→观察，编号并记录。

观察和记录完毕后，挑选不同菌落中的每一菌株制成水浸片（染色），并编号。将各个水制片在高倍镜下观察各株菌的个体形态，并记录。选出具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，用灭菌后的接种环挑去不同菌落，在分离培养基上连续划线分离2~3次，进行纯化。

菌种的保藏：

分离纯化得到的酵母单菌落接种于培养基进行液体培养，培养的条件为：温度是 28 ℃，转速为180 r/min，时间为 18～24 h。当菌体培养好后，将菌液和灭菌后的甘油按体积比为 7: 3 的比例进行混合，混合摇匀后于-20 ℃下保藏待用。

PS：以上分别进行培养基筛选试验，可选培养基：

（1）PDA培养基：

去皮马铃薯300g，加水煮沸10～20min，过滤加入葡萄糖200g，加水至1L。灭菌。

（2）YEPD：

葡萄糖20g、蛋白胨20g、牛肉膏10g、琼脂20g、水1000ml

将葡萄糖溶解在水中，添加蛋白胨及酵母浸膏，混匀后，加琼脂溶化，灭菌。

YEPD液体培养基：酵母浸粉 10 g/L,胰蛋白胨 20 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂15 g/L, 固体培养基可加入2 %琼脂。

第二部分：酿酒酵母筛选及其鉴定

一筛选

1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选

对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。

2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母

WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌 20 min；

将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。

3 赖氨酸培养基筛选

赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁 200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结晶硫酸镁500mg，氯化钠100mg，结晶氯化钙100mg，赖氨酸盐酸盐2.5g，琼脂20g，pH 自然，121℃灭菌 20 min；

接种液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种酵母到5mL无菌水中进行饥饿处理，5d后，接种到赖氨酸培养基，27℃培养 5d 后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到 15d 后仍无菌落生长说明可能是酿酒酵母。

二酿酒酵母的鉴定

1. 形态与培养特征

将菌种接种到液体培养基中，25℃培养3～7d，观察是否发酵、培养液是否混浊，是否形成环或岛，沉淀量多少及松紧状况，并制水浸片于显微镜下观察，记录酵母的无性繁殖方式与细胞的形状。将酵母在琼脂培养基上划线，于28℃培养3d～4d，观察其菌落形态。

2. 酵母假菌丝的观察

将菌株在25℃活化后，在琼脂平板上划线接种(每个平板2-3 条)，