pcr检测流程

【操作方法及步骤】

一、脱蜡

1. 根据FFPE 切片组织面积的大小，刮取1~5 片FFPE 样品至1.5 mL 离心管中，加入1 mL 二甲苯，振荡混匀10 s；

2. 室温14000 rpm 离心2 min，小心去除上清（勿吸到沉淀）；

3. 加入1 mL 无水乙醇，振荡混匀10 s，室温下14000 rpm 离心2 min，小心去除上清（勿吸到沉淀）；

4. 室温开盖放置10 min 或37℃下开盖放置5 min，使乙醇充分挥发。

二、DNA 分离

1. 加入180 μL Buffer DTL 及20 μL Proteinase K Solution，振荡混匀，56℃消化1 h，如样品量较多，可消化过夜；

2. 加入10 μL Buffer DES，混匀后放入温度已升至90℃的恒温加热器中，孵育1 h；

3. 掌式离心机离心5~10 s。如有需要，可加入2 μL 100 mg/mL RNase

A，室温放置5 min 以去除RNA；

4. 加入200 μL Buffer DTB 和200 μL 无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心5~10 s；

5. 将全部液体转移至DNA 吸附柱中，8000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的液体；

6. 往DNA 吸附柱中加入600 μL Buffer DW1，8000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的液体；

7. 往DNA 吸附柱中加入600 μL Buffer DW2，8000 rpm 离心1 min，丢弃收集管；

8. 换用新的收集管，14000 rpm 离心3 min，丢弃收集管；

9. 将吸附柱小心转移至干净的1.5 mL 离心管中；往DNA 吸附膜中心滴加30~100 μL Buffer DTE（勿碰到DNA 吸附膜），室温静置1~5 min，14000 rpm 离心1 min，收集样品DNA 并保存；

10. 所分离的DNA建议马上使用，如超过6 h未使用，请于-20℃以下保存。

【上机检测流程】

1.取出阳性质控品和Taq酶(EGFR21)，阳性质控品先解冻，再振荡混匀。阳性质

控品和Taq酶(EGFR21)需快速离心15秒待用。

2.向42.3μl待测样品DNA（样品DNA浓度参见如下）中加入2.7μl Taq酶

(EGFR21)，向42.3μl阳性质控品(STD)中加入2.7μl Taq酶(EGFR21)，向

42.3μl 超纯水（NTC）中加入2.7μl Taq酶(EGFR21)，涡旋器上混匀15秒，

然后快速离心15秒。

a)根据样品来源不同，可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。新鲜

病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。

b)石蜡切片样品的DNA浓度推荐为2ng/μl~3ng/μl，即每单个反应管添加

的DNA量为9.4ng~14.1ng。根据石蜡切片样品保存的年限不同，建议：保

存不超过三年的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA量为9.4ng；保存

超过三年的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA量为14.1ng。

c)非石蜡切片样品的DNA浓度推荐为0.4ng/μl~1ng/μl，即每单个反应管

添加的DNA量为1.88ng~4.7ng。

3.在PCR管冰架上，轻轻揭开8联PCR管反应条的条盖。

4.将混好的DNA样品依次取5μl加入8联PCR管反应条，然后小心盖上8联PCR管

反应条管盖。

5.离心或轻甩8联PCR管反应条。

6.将8联PCR管反应条放入实时PCR仪器。PCR反应板布局见表4中推荐方法。

7.打开仪器窗口，按照下图中说明的扩增程序图进行设置。

第一阶段：95℃ 5分钟，1个循环；

第二阶段：95℃ 25秒，64℃ 20秒，72℃ 20秒，15个循环；

第三阶段：93℃ 25秒，60℃ 35秒，72℃ 20秒，31个循环；

信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX信号（或VIC信号），执行实时PCR，保存文件。