血小板聚集功能检测及临床应用

血小板的聚集是由各种诱导剂与血小板膜受体之 间的相互作用而诱发的：这种相互作用通过膜的 传递而激活血小板,使其膜表面另一个糖蛋白 IIb/IIIa受体活化,再与血浆中的纤维蛋白原结合,介 导血小板聚集。（三要素：GPIIb-IIIa和钙离子、 纤维蛋白原）
目前认为有三条途径： 1.ADP途径，ADP、胶原、凝血酶、肾上腺素等
当今抗血小板药主体
ASA
P2Y12受体拮抗剂
GPⅡb/Ⅲa拮抗剂
抗血小板药物:血栓素 A2 抑制剂
阿司匹林，ASA
临床应用最早、最多的第一代抗血小板药物, 其作用机制是使血小板的环氧酶(PG合成酶) 乙酰化,抑制血栓素A2(TXA2)的合成,还可使 血小板膜蛋白乙酰化,并抑制血小板膜酶。 国内外研究均表明,每天口服阿司匹林 100mg,抑制血小板聚集作用最明显,且耐受 性好、安全性高。
阻抗法的优点
直接使用全血 全血中的其他血细胞同时存在，从而真正模拟
了体内的生理环境 保存全部血小板，避免部分血小板因体积太大
而在制备PRP时丢失 对于脂血标本的检测，可以克服光学法检测时
因过于浑浊而影响结果 全血电阻聚集仪与光学法相比，检测高凝状态
时的血小板功能更为敏感
阻抗法的不足之处
切应力 凝血酶--抗凝血酶 5-HT--5HT拮抗剂 ADP--波利维、抵克力得 TXA2--TXA2受体拮抗剂
GPIIb/IIIa拮抗剂
血小板聚集
抵克力得 氯吡格雷
肾上腺素
凝血酶
内皮细胞 前列环素
花生四烯酸代谢
ADP
TXA2
阿斯匹林
↑cAMP
↑ Ca2+
花生四烯 酸代谢
TTXXAA22
颗粒 释放
均可诱导血小板释放内源性ADP。后者可引起血 小板聚集。 2.TXA2途径：PGG2、PGH2及TXA2可诱导血小 板发生聚集反应，但不依赖ADP途径。 3.PAF途径：PAF通过与血小板膜上的PAF受体 结合而发挥作用，引起血小板聚集。
目前血小板聚集功能的检测已经从传统的 手工法发展到全自动仪器的检测,从单一的 比浊法发展到阻抗法,剪切法,流式细胞术法、 模拟体内初期止血（PFA-100）等等, 从单 一的测定血小板聚集功能发展到能同时检 测血小板释放ATP和血小板内Ca2+的含 量，血小板释放颗粒及活化功能的测定， AA代谢产物测定，血小板内环腺苷酸 ( cAMP)和环鸟苷酸 ( cGMP)测定，血小板 活化的新标志物等等。
注意事项
时间 应在采血后3小时内完成。
温度 采血后标本应在15-30°C 的室温放置。切忌放 入冰箱。
血6.5浆-8的.5p的H标采本血可后获血得液最中佳的效C果O。2不所断以逸一出般，在使实p验H上前升半。 小时开盖为宜。
饮食 最好空腹，禁饮牛奶、豆浆和脂肪性食品。
诱导剂 ADP在保存中会分解，配制后最好分装，在20°C以下的冰箱中保存。肾上腺素更容易分解，应 以黑纸包裹避光。
光学聚集仪耗时,对小聚集物的形成不敏 感,，操作相对烦琐。
阻抗法与比浊法的结果无法换算。 尚缺乏大量应用的经验。
血小板功能分析仪 ( PFA-100)
这是近年才出现的新仪器 ,目前 PFA-100系统是 血细胞功能检测研究最多的方法之一。它在高切 变率下 ,利用多种激活剂进行血小板功能的测定 , 在检测血小板功能的临床工作中取得较多进展。 血小板功能分析仪模拟体内初期止血 ,又名“外出 血时间测定 ” ,检测与血小板黏附、 聚集、 栓子 形成的初期止血障碍相关的疾病 ,也可监测抗血小 板药物治疗。
ADP 肾上腺素 5-羟色胺
PDGF
GP IIb/IIIa 受体拮抗剂
GP
潘生丁
1b
vWF
暴露的内皮下胶原
配体受体
纤维蛋白原
无活性
GP IIb/IIIa 受体
(Fig 3)
刺激 抑制
GP = glycoprotein; PDGF = platelet derived growth factor; vWF = von Willebrand factor cAMP = cyclic adenosine monophosphate ADP = adenosine diphosphate TXA2 = thromboxane A2
不同诱导剂可产生不同类型的血小板聚集曲线：
ADP诱导血小板聚集在低浓度时(<3umol/L)是可 逆性聚集,即初期聚集波、还能引起血小板释放 ADP而产生第2个聚集波;在高浓度时(>3ugmol/L) 是不可逆性聚集。可使全部血小板对外源性ADP 产生反应而立即得到1个单一的聚集波；
2、剩余标本在室温下3000rpm 10-15分钟或1600-2000×g 1015分钟离心制备贫血小板血浆（PPP）。用塑料移液管将PPP转 移至标有PPP标签的塑料试管并盖上盖子保持室温。
3、计数PRP的血小板浓度。通过自体PPP调节PRP使之血小板 计数达到200×109/L。血小板计数低于100×109/L时可以造成异 常结果。举例：PRP为300×109/L， 反应体系 300µL，血小板 数量应为200×109/L，根据C1V1=C2V2，则加入PRP的体积= 300µL ×200×109/L÷ （300×109/L）=200µL，加入PPP的 体积 = 300µL-200µL=100µL。
(3)血小板的释放反应 血小板活化剂可以直接引 起血小板释放反应并引起二相血小板聚集
(4)促凝作用 PF3可提供催化表面；完成因子X和 因子II的活化。另外，血小板内容物中包含有种类 较多的凝血因子，血小板活化释放时，因凝血因 子的释放而加强局部的凝血作用。
(5)血块收缩功能 活化的血小板释放血块收缩蛋 白，使血块收缩，有利于创口的缩小和愈合。
生物参考区间 各实验室应对试剂说明书提供的生物 参考区间进行验证。
质量控制
室内质控：用已知正常人的混合PRP标本 建立典型的血小板聚集模式。这些模式的 正常值用来同结果显著异常的标本进行比 较就可以表明血小板机能障碍。最好每次 试验前做一混合PRP作为当日正常对照。
血小板聚集试验的应用
适当浓度的肾上腺素亦可引双聚集波曲线,胶原引 起的聚集曲线与ADP和肾上腺素不同,不能直接聚 集血小板,而是引起血小板内释放ADP等诱导聚 集；
瑞斯托霉素与vWF相互作用引起血小板GPIIb/IIIa 受体激活而导致小板聚集。
血小板聚集试验（阻抗法）
原理 可用全血或PRP进行检测。检测杯中 有一对铂电极，血小板在诱导剂的诱导下发 生聚集时，可覆盖在铂电极表面，导致电阻 抗的改变，后者的变化程度与聚集程度有关。 此信号经过放大传送到监测器或计算机上进 行处理，将电阻抗的改变转换为聚集曲线从 而计算出血小板的聚集率。
ASA抵抗
实验室定义
为服用ASA患者未能产生对血小板的 活化和聚集预期 的抑制作用:
10µM ADP时聚集率>70%, 0.5mg/ml AA 时聚集率>20%。
两条都符合为完全抵抗，符合一条为半抵抗。
临床定义
为缺血事件发生率增高
ADP-受体拮抗剂 --氯吡格雷（波立维、泰嘉）
噻氯匹定、氯吡格雷均为二磷酸腺苷(ADP)受体拮 抗剂,属第2代抗血小板药物。可与血小板ADP受体 结合,抑制ADP激活的血小板聚集及ADP介导的血小 板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的活性受阻。噻氯匹定 起效慢,不适应急性冠脉综合征的早期治疗。噻氯 匹定还可致中性粒细胞和血小板减少(需定期复查 血象),其他不良反应也较氯吡格雷多见。
血小板聚集被ASA抑制时的图形
100 血 小 板 聚 集 50 率
%
部分抑制
ADP
ADR Col
AA
2
4
6
8
10
时间（分）
完全抑制
ADP
Col
AA
ADR
2
4
6
10
时间（分）
阿司匹林的实验室监测
出血时间（BT）：以BT延长至治疗前的 2.0～2.5倍为宜。
血小板聚集功能测定：应以花生四烯酸作 为诱导剂，以最大聚集率降至正常的 20% ～30%为宜。
白细胞、血小板计数：若有白细胞明显 减少或血小板降低应立即停药。
氯毗格雷抵抗
氯毗格雷抵抗日前尚无明确定义，与阿司 匹林抵抗类似，用于描述氯毗格雷治疗后 不良心血管事件的发生或血小板对氯毗格 雷低反应或无反应。
GPⅡb/Ⅲa拮抗剂的作用机制
血小板膜GPⅡb／Ⅲa受体存在于血小板膜 表面，在血小板激活时大量表达，是引起血 小板聚集的共同通路。所有血小板诱导剂 (5-HT、ADP、凝血酶、血栓素、NE等)与各 自受体结合后，都必须经血小板膜GPⅡb／ Ⅲa受体才能引起血小板聚集。因此，无论 是血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体单克隆抗体还是 竞争性受体抑制剂，均是强烈的血小板聚集 抑制药物。
三大功能: 一、பைடு நூலகம்血小板药物的监测 二、血小板功能异常的诊断 三、血栓性疾病的监测
抗血小板药物的监测
血小板的作用
(1)血小板粘附功能 血小板可直接粘附于血管内 皮下成分，如胶原及弹性蛋白等，亦可通过vWF 及纤维连接蛋白等粘附蛋白介导而发生粘附。
(2)血小板聚集功能 血小板聚集是血小板参与止 血和血栓形成的重要环节，当血小板粘附于血管 破损处或受到凝血酶、ADP等活化剂作用后即被 活化，活化的血小板相互粘附在一起即为血小板 聚集。血小板聚集与GPIIb- IIIa、纤维蛋白原、 钙离子有关。
原理（比浊法）
将富血小板血浆(PRP)置于比色管中,加入 诱聚剂(主要有ADP、肾上腺素,胶原,凝血 酶、花生四烯酸、TXA2,PAF等),用一涂硅 的小磁粒进行搅拌,血小板逐渐聚集,血浆浊 度降低,透光度增加,记录此变化,形成血小板 聚集的动态曲线,以PRP的聚集率和透光度 为0%,乏血小板血浆(PPP)所测得的聚集率 和透光度为100%,用血小板聚集仪进行自动 测定、记录、描绘血小板聚集曲线。
V1——血量，ml α——红细胞压积
* HCT低,抽血3 ml ; HCT高,抽血4 ml
标本制备 1、所有抗凝标本在室温下1000rpm 10分钟或200×g 10分钟离
心制备富含血小板血浆（PRP）。不要使用离心机刹车。用塑料 移液管将PRP转移至标有PRP标签的塑料试管中（吸取时注意避 免吸入红、白细胞，下同）。PRP制取后在试验前应盖上盖子并 在室温放置30分钟。
(6)维护血管内皮的完整性 血小板能填充受伤内 皮细胞所造成的空隙，参与血管内皮细胞的再生 和修复过程，能增强血管壁的抗力，减低血管壁 的通透性和脆性。
抗血小板药物拮抗血小板活化的各阶段
前列腺， NO，潘生丁
内皮细胞
GPIb/vWF 拮抗剂
鱼油，ASA非甾 体抗炎药、 TXA2合成酶抑 制剂
血小板黏附 血小板活化 血小板释放
血小板聚集功能的检测及 临床应用
广东省人民医院 广东省医学科学院 病理医学部检验科
李广华
前言
血小板聚集功能的检测对于抗血小板药物 的疗效监测，出血性疾病的鉴别和诊断以 及对血栓性疾病的监测都具有重要的意义。
Born于1962年首先应用比浊法检测血小板 聚集功能，该技术是测定血小板聚集功能 的经典方法 ，应用最为广泛 。
血小板聚集功能检测（比浊法）
标本采集 1、抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠抗凝，BD公司真空蓝头试
管， 0.3mL抗凝剂+2.7mL全血。 2、标本采集：空腹静脉穿刺，采集量为2管。 3、注意事项：采集过程顺利，一针见血；避免反复穿刺而抽
到组织液或气泡；迅速颠倒试管混匀全血3-4次；标本运送过 程保持室温，避免剧烈震荡。 4、对于红细胞压积：HCT<35%或>55%时 V=0.00185×V1×（1.00-α）×100 式中：V——柠檬酸钠用量
氯吡格雷抗血小板作用较噻氯匹定强、起效快、耐 受性好、安全性高,是目前评价最高、应用最多的 抗血小板药物。
ADP-受体拮抗剂的实验室监测
出血时间（BT）：以BT延长至治疗前的 2.0～2.5倍为宜。
血小板聚集功能测定：应以ADP作为诱导 剂，以最大聚集率降至正常的20% ～30% 为宜。
血小板功能分析仪 ( PFA-100)
优点：该方法操作简便易行、 重复性好 ,与 光学血小板聚集仪法相关性较好 ,比出血时 间等方法更为敏感。而且能检测血小板功 能失调是原发性因素还是药物影响所致。
缺点：其对出血性疾病尚不能非常精确地 预测 ,而且其结果也受很多因素影响 ,如血 小板数量、 红血细胞压积、 血型及血浆中 vWF水平等都会影响其结果。费用较高。