32 酶的提取与分离纯化280
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S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β 表示，盐析方程式可改写为：
①基本原理（盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中 加入中性盐，可产生两种现象：
●盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。
●盐析（salting out） ： 高浓度的析
离子强度
硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
★
原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子
，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同
盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先 后析出，称分段盐析。
★
蛋 白 质 分 子 表 面 的 疏 水 区 域 和 荷 电 区 域
★
★
②盐析用盐 ●常用（NH4）2 SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜
●pH值：等电点处最易沉淀。 ●温度的影响：
稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。 浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶， 可在0℃～4℃下操作。
★
2.2 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 ① 沉淀机理
log S = β- Ks I 两种盐析法：
Ks分级盐析法 ：在一定的pH和温度条件下，利用不 同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即 改变I值）的沉淀方法。
β分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶液
的pH及温度的沉淀方法。
★
●蛋白质浓度：
稀回收沉淀难，浓易共沉淀，2.5%-3%最好。
32 酶的提取与分离纯化280
★
2、沉淀分离（根据溶解度的不同）提取
特点:使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法
生物大分子制备中常用沉淀方法： 1 中性盐沉淀（盐析法） 2 有机溶剂沉淀 3 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 4 等电点沉淀 5 有机聚合物沉淀
★
2.1 盐析沉淀法（改变离子强度）
★
③ 盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度＝ 溶液的总体积
★
④调整盐浓度的方式 ⑴饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐 浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液. 所需添加饱和硫酸铵溶液的体积：
S2-S1 V=V0——1-—S2—
V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度
★
3 等电点沉淀 2.
(isoelectric precipitation)
① 原理
蛋白质在等电点时溶解度最低
不同的蛋白质具有不同的等电点
② 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较
大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机
溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。
★
高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液 体积。 注意:固体硫酸铵要研细，温和搅拌中缓慢加入。 冰箱中（4℃）过夜，待沉淀完全后高速离心。 沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透 析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
⑶盐析曲线的制作
★
如要分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀
★
⑵添加固体硫酸铵 适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的 盐浓度又很高时。
按下式计算，得表中数据 B(S2-S1)
W= —————— 1-AS2
A,B——常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加固体硫酸铵
的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
★
★
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均 匀，一般终饱和度不超过40％。
③优点： 大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内; 无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低; 无需除掉多余酸即可进行下一步纯化.
④缺点 酸化时，容易引起蛋白质失活
2.4 有机聚合物沉淀法
★
① 作用机理：
与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
② 沉淀剂：
常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG ）
多用分子量为6000～20000的 PEG。
③优点：
操作条件温和，不易引起生物大分子变性;
沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当
多的生物大分子;
沉淀后有机聚合物容易去除。
★
2.5 选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白 质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
①热变性 所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升 高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 ② pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 ③有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。
3、萃取（extraction）分离 自学
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 ②常用有机溶剂 丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
★
③ 优缺点： 优点：分辨率比盐析法高
沉淀不需脱盐 溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
★
④ 影响有机溶剂沉淀的因素 温度 ：低温（0℃）操作。 pH 值：尽可能靠近其等电点。 离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液, 增加蛋白质在有机溶剂中的 溶解度,目的防止蛋白质变性 蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml
该物质的硫酸铵饱和度。
蛋白质量(mg)或酶活力
硫铵饱和度％
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
★
硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线
⑷盐析的影响因素
★
●离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loS g loS 0 g K sI
I：离子强度，I = ∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β 表示，盐析方程式可改写为：
①基本原理（盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中 加入中性盐，可产生两种现象：
●盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。
●盐析（salting out） ： 高浓度的析
离子强度
硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
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原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子
，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同
盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先 后析出，称分段盐析。
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蛋 白 质 分 子 表 面 的 疏 水 区 域 和 荷 电 区 域
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②盐析用盐 ●常用（NH4）2 SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜
●pH值：等电点处最易沉淀。 ●温度的影响：
稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。 浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶， 可在0℃～4℃下操作。
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2.2 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 ① 沉淀机理
log S = β- Ks I 两种盐析法：
Ks分级盐析法 ：在一定的pH和温度条件下，利用不 同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即 改变I值）的沉淀方法。
β分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶液
的pH及温度的沉淀方法。
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●蛋白质浓度：
稀回收沉淀难，浓易共沉淀，2.5%-3%最好。
32 酶的提取与分离纯化280
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2、沉淀分离（根据溶解度的不同）提取
特点:使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法
生物大分子制备中常用沉淀方法： 1 中性盐沉淀（盐析法） 2 有机溶剂沉淀 3 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 4 等电点沉淀 5 有机聚合物沉淀
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2.1 盐析沉淀法（改变离子强度）
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③ 盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度＝ 溶液的总体积
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④调整盐浓度的方式 ⑴饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐 浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液. 所需添加饱和硫酸铵溶液的体积：
S2-S1 V=V0——1-—S2—
V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度
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3 等电点沉淀 2.
(isoelectric precipitation)
① 原理
蛋白质在等电点时溶解度最低
不同的蛋白质具有不同的等电点
② 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较
大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机
溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。
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高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液 体积。 注意:固体硫酸铵要研细，温和搅拌中缓慢加入。 冰箱中（4℃）过夜，待沉淀完全后高速离心。 沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透 析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
⑶盐析曲线的制作
★
如要分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀
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⑵添加固体硫酸铵 适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的 盐浓度又很高时。
按下式计算，得表中数据 B(S2-S1)
W= —————— 1-AS2
A,B——常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加固体硫酸铵
的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
★
★
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均 匀，一般终饱和度不超过40％。
③优点： 大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内; 无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低; 无需除掉多余酸即可进行下一步纯化.
④缺点 酸化时，容易引起蛋白质失活
2.4 有机聚合物沉淀法
★
① 作用机理：
与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
② 沉淀剂：
常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG ）
多用分子量为6000～20000的 PEG。
③优点：
操作条件温和，不易引起生物大分子变性;
沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当
多的生物大分子;
沉淀后有机聚合物容易去除。
★
2.5 选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白 质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
①热变性 所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升 高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 ② pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 ③有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。
3、萃取（extraction）分离 自学
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 ②常用有机溶剂 丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
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③ 优缺点： 优点：分辨率比盐析法高
沉淀不需脱盐 溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
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④ 影响有机溶剂沉淀的因素 温度 ：低温（0℃）操作。 pH 值：尽可能靠近其等电点。 离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液, 增加蛋白质在有机溶剂中的 溶解度,目的防止蛋白质变性 蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml
该物质的硫酸铵饱和度。
蛋白质量(mg)或酶活力
硫铵饱和度％
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线
⑷盐析的影响因素
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●离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loS g loS 0 g K sI
I：离子强度，I = ∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数