PCR(聚合酶链式反应)实验报告

– 实验设计：
• 对照：Msgg培养基+菌液 • 阴性对照：Msgg培养基+菌液+DMSO • 实验组：Msgg培养基+菌液+不同浓度梯度的化合物
– 实验结果
• 初步了解EKA对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色 葡萄球菌均有抑制作用，且浓度越高抑制作用越强
实验报告
2019.7.29~2019.9.1
PCR（聚合酶链式反应）
• 1.目的：在物质中提取的DNA量较少，之后大量扩增， 获得大量目的片段
• 2.原理及过程：
– 热变性
• 温度：95度（计算方法：每对AT为2度，CG为4度） • 过程：DNA双链断裂形成单链
– 复性
• 温度：55度 • 过程：引物配对上DNA单链
• 1.配胶、制胶
– 用量：25ml 大小的胶需要2.0 g的琼脂糖凝胶固体。 若目的DNA片段量过小可增加琼脂糖凝胶的浓度； 相反，若DNA片段过大，可降低琼脂糖凝胶的浓度
– 方法：配胶用单蒸水溶解，在微波炉中加热，放置 微烫手，再加入核酸染液约20微升，可倒入胶板中 等待凝固
• 加样
– 在一次性手套上将Loading Buffer 与样液混匀 （6×Loading Buffer为Loading Buffer：样液=1：5）
– 延伸
• 温度：72度 • 过程：DNA酶催化DNA互补链的延伸
– 循环（大约循环20~30次）
• 3.反应成分
– 模板DNA、引物、dNTP、Mix 缓冲液（DNA 聚合酶、镁离子）、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ离子水
• 4.方向：5’~3’ • 5.产生数量
• 反应初期以指数形式增加，之后进入平台期
聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 对致病菌的认识：
– 枯草芽孢杆菌：阳性菌，形成的细胞膜在液体与 气体表面，褶皱
– 铜绿假单胞菌：阴性菌，形成的细胞膜在液体底 部
– 金黄色葡萄球菌：阳性菌，形成的细胞膜在液体 底部
• 对成膜条件的尝试
– 将涂平板的细菌接入液体培养基（LB）中，摇床 24小时左右
– 在酶标仪中测量LB 中的细菌数，将细菌稀释到 5×10^5 ，放入24孔板中培养，总体积约1~1.5ml
保种
• 保种液：
– 25%甘油：将菌液低转速（5000rpm）大约离 心2600ml 的菌液（2管离心管）
– 50%甘油：将菌液和保重液同体积混合
• 保种贮藏
– 加入600~700微升的保种液，放置在-80度中 （保种管、离心管）保存
生物膜的抑膜与解膜
• 抑膜与解膜的定义：抑膜是在细菌生长的同时 加入化合物是细菌不成膜；解膜是利用化合物 降解已存在的细胞膜。