检测口蹄疫血清抗体的方法

检测口蹄疫血清抗体的方法

（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）

该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料 V型96孔110。医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法

接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：

64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。

⑤滴加正向血凝诊断液取正向血凝诊断液充分摇匀（瓶底应无血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振荡器上振荡1分钟，取下血凝板放在白纸上观察每孔中的血球是否均匀（孔底应无血球沉淀）。如仍有部分孔底出现血球

沉积，应继续振荡直至完全混匀为止。

⑥静置将血凝板放在室温下（15~30℃）静置2h后判定检测结果，若结果

不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定标准先观察10~12孔（对照孔），第10孔为阴性血清对照，应无红细胞凝集现象，红细胞全部沉入孔底，形成小园点或仅有25%红细胞有凝集（“+”的凝集）；第11孔为阳性血清对照，应出现“++”以上的凝集（50%以上的红细胞发生凝集），证明该批正向诊断液的效价达到1：512为合格；第12孔为稀释液对照，红细胞也应全部沉入孔底或只有“+”的凝集。

在上述对照合格的前提下，观察待检血清各孔，以出现“++”凝集的待检血清最大稀释度为其抗体效价。例如检测接种口蹄疫O型灭活疫苗的猪群免疫水平时，某份血清1-7孔出现“++”或“++”以上（+++~#）凝集而第8孔仅有“+”凝集，判定该份血清中的O型抗体效价为1：128。

经实验室测定，口蹄疫O型灭活疫苗的免疫猪群血清中O型抗体效价达到1：128及其以上时，猪群可耐受20个O型强毒发病量的人工感染。

（2）用于鉴别诊断的正向间接血凝试验

①稀释待检血清取中试管8支列于试管架上，第1管加稀释液毫升，第2~8管各加稀释液毫升，取待检血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升加入第2管……直至第8管，待检血清的稀释度依次为1:4、1：8、1：16、1：32、1：

64、1：128、1：256、1：512。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升 ,即成1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，列于管架上，每管加稀释液毫升阳血，依次用记号笔标明O、A、C、Asia型和SVD阳血，分别取这5种阳性血清10微升加入相应的试管中（注意每加一种阳性血清，必须单独使用一根吸管），盖上橡胶塞充分摇匀，阳性血清的稀释度即成1：500。

④滴加待检血清和对照血清取第8管待检血清加入血凝板上的1~5排第8孔，取7管血清加入1~5排的第7孔，取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔 50微升。取阴性血清（1：16稀释度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。取1：500稀释的阳性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。取稀释液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。

⑤滴加正向间接血凝抗原（正向诊断液）第1排1~8孔和10~12孔加O型血凝抗原，每孔25微升。第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。第五排1~8孔和10~12孔加

SVD血凝抗原，每孔25微升。加毕抗原后立即将血凝板置于微量振荡器上中速振荡1分钟，使抗体和抗原充分混匀，各孔不应有红细胞沉淀。

⑥静置从振荡器上取下血凝板，放在试验台上，盖上玻板，室温（15~30℃）静置2小时，判定结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。

⑦判定标准先仔细观察每排的10~12孔，10孔为阴性血清对照，12孔为稀释液对照，这2孔均应无凝集现象，或仅出现“+”的凝集。11孔为口蹄疫4个型和猪水泡病1：500稀释的阳性血清对照，应出现“++” ~ “+++”的凝集，证明所使用的5种血凝抗原试剂合格。

在对照孔符合上述标准的前提下，观察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出现“#”~“++”的凝集，其余4排仅在1~3孔出现“++”~“+”的凝集，便可判定该份待检血清为阳性，其型别与所加的血凝抗原的型别相同。例出第1排的1~3孔出现“#”凝集，第4-5孔出现“+++”凝集，第6孔出现“++”凝集，第7孔出现“+”凝集，第8孔无凝集（“—”），判定该份待检血清为口蹄疫O型，表明血清中存在O型抗体其效价为1：128。如果该份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫过的动物，就不能判定究竟是自然感染产生的抗体，还是接种过疫苗产生的抗体。因为本法尚不能区分感染性抗体和免疫性抗体。为此，欲使本法用于鉴别诊断，采血时必须要弄清该批动物是否接种过口蹄疫或猪水泡病疫苗。

⑧注意事项

A．严重溶血和污染的血清样品不宜检测，以免产生非特异反应。

B．勿用90o和130o血凝板，以免误判。

C．有时会出现“前带”现象，即第1~2孔红细胞沉淀而在第3~4孔又出现凝集，这是由于抗原抗体比例失调所致，不影响结果的判定。

D．血清必须是来自康复动物，至少是发病后10天的血清，否则不易检出。

注：稀释液配方如下：

Na

2HPO4·12H

2

O (磷酸氢二钠) 35.8克

Na

2H

2

PO4·2H

2

O （磷酸二氢钠) 1.56克

NaCl （氯化钠） 8.5克

NaN

3

（迭氮钠） 1.0克

加双蒸水或去离子水至1 000毫升，15磅高压灭菌20分钟，冷却后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱贮存备用。该配方适用于正向间接血凝试验和反向被动血凝试验，也适用于猪瘟间接血凝试验。

正向间接血凝抗原及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫综防研究组提供。

（二）口蹄疫中和试验