细胞培养2_人类外周血染色体制备

人类外周血染色体制备

一、原理

人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。

二、用品和试剂

1．5ml注射器（7号针尖），培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。

2．超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。

3．试剂：

（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0

克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。

（2）肝素钠（肝素）：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，15磅20分钟灭菌。

（3）秋水仙碱（秋水仙素〕，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置－20℃。

（4）低渗液：0.35％KCl。

（5）固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。

（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。

（7）磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。

（8）5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

三、操作步骤

（一）细胞培养

1．培养基的配制：

在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：

RPMI-1640 84ml

小牛血清15ml

PHA 3支

肝素钠1ml

卡那霉素终浓度为100单位/ml

以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。

用刻度吸管将培养液分装入培养瓶（10ml/瓶），4℃备用。

2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3—0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30—40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。

3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。

4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用

1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）。

以上步骤均需无菌操作

（二）染色体制备

1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分