干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测

三个方向诱导分化

诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化

一、诱导方法

将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)

转化生长因子β1 10ng/ml,

（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)

地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）

ITS 50mg/ml

丙酮酸钠1mmol/L

亚油酸5.35ug/mg

牛血清白蛋白1.25ng/ml。

倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。细胞长成单层后进行传代。

细胞培养3周。去除培养液,晾干,

①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；

②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,

麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，

显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：

MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：

培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，

10％甲醛固定lh，

自来水冲洗15min，

双蒸水冲洗1次，

滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，

加人95％乙醇，洗去多余的染液，

烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化

成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为

0.1 的新生牛血清、

0.1 μmol/L 地塞米松、

50 μmol/L 抗坏血酸、

10 mmol/L β- 甘油磷酸钠

的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测:

①碱性磷酸酶组织化学染色:

取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。

:

取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12,

14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

③钙结节染色:

Von Kossa’s矿化结节染色法

原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。

Van kossa银染色法

试剂：

1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。

2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。

培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次

2. 2%硝酸银内置暗处1小时

3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟

4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）

5. 5%硫代硫酸钠1小时

1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；

2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤；

3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；

4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。

1. Sections to water. 切片脱蜡至水

2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes.

置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟

3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗

4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟

5. Wash in water. 用水漂洗

6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟

7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗

8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片

结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色.

A 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本,

1 %硝酸银溶液紫外线下染色10min ,

用 5 %硫代硫酸钠染色2min ,

1 %中性红复染10min ,

酒精冲洗后观察。

B 组以改进的方法染色:

4 %多聚甲醛固定标本,

,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色30min ,

蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质,

继续用 5 %硫代硫酸钠染色2min ,

1 %中性红复染10min ,蒸馏水漂洗后观察。

或取成骨诱导21 d 的细胞, 体积分数为0.95 的乙醇固定15 min,

10 g/L 茜素红S 染液在室温下浸染10 min,

去离子水洗涤3次,

倒置显微镜下观察。

二、茜素红染色