连接酶类

思考题： 思考题：
1、试述工具酶的发现与使用对基因工程的意义以及 对我们的启示。 对我们的启示。 设想进一步开发应用工具酶的潜力和前景。 2、设想进一步开发应用工具酶的潜力和前景。 型限制酶切割DNA分子的特性？ DNA分子的特性 3、Ⅱ型限制酶切割DNA分子的特性？ 应用限制酶切割DNA分子需注意什么？ DNA分子需注意什么 4、应用限制酶切割DNA分子需注意什么？ 连接酶作用于DNA片段连接反应的特性与条件？ DNA片段连接反应的特性与条件 5、连接酶作用于DNA片段连接反应的特性与条件？ 分析不同的聚合酶在分子克隆技术中的作用？ 6、分析不同的聚合酶在分子克隆技术中的作用？ 归纳各种修饰酶在基因工程中的主要用途。 7、归纳各种修饰酶在基因工程中的主要用途。
基因操作的工具酶
连接酶类
主要内容： 主要内容：
DNA连接酶（ligase）
基因工程技术常用的两种连接酶，一个是大肠杆菌 基因工程技术常用的两种连接酶， DNA连接酶 分子量为7500 连接酶, 7500， 供能。另一个是T DNA连接酶,分子量为7500，由NAD+供能。另一个是T4噬菌 体基因编码， 称为T DNA连接酶 分子量为6000 连接酶， 6000， 体基因编码 ， 称为 T4DNA 连接酶 ， 分子量为 6000 ， 由 ATP 供能。 供能。
DNA连接酶 连接酶
动物、 动物、噬菌体 ATP 细菌 (NAD+)
AMP+PPi
(NMN+ + AMP)
未缺失核苷酸的切口
缺失核苷酸的裂口
连接酶作用的基本要求
图示DNA连接酶的作用
图示DNA连接酶的作用机理
（尼克酰胺单核苷酸） （尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）
DNA连接酶的作用机理
两种来源的连接酶催化DNA 切口的连接过程基本相同。首先 由 NAD+或ATP与连接酶反应，形 成腺苷酸化的酶（酶-AMP复合 物），其中AMP的磷酸与酶蛋白 中的赖氨酸ε—氨基以酰胺键结 合。然后酶将AMP转移给DNA切口 处的5´-磷酸，以焦磷酸键的形 式活化，形成AP—P—DNA，随后 通过相邻的3´-OH对活化的磷原 子发生亲核攻击，生成3´，5´磷酸二酯键，同时释放出AMP。
E·coli DNA ligase……NAD﹢ （能量） T4 DNA ligase…… …ATP （能量）
DNA连接酶（DNA ligase） 连接酶（ 连接酶 ）
• 催化双链 催化双链DNA切口处 ′ - 磷酸基和 ′ - 羟基生成 切口处5′ 磷酸基和3′ 切口处 磷酸二酯键。 磷酸二酯键。
图示黏末端的退火
粘末端连接方式
点评： 点评： 最常用、最好用。 最常用、最好用。 能原位酶切获取外源DNA片段。 能原位酶切获取外源DNA片段。 DNA片段 缺点：易自身环化。 缺点：易自身环化。
连接方式（2）
平末端的直接连接：
1、将平末端的DNA片段混合，加入 T4 DNA ligase连接。 2、将任何黏末端的DNA片段修饰为 平末端，加入T4 DNA ligase连接。。
DNA分子的连接形式
分 子 间 连 接 与 分 子 内 连 接
两条DNA片段之 间共价连接的形式， 称为分子间的连接。 一条DNA片段自身环 化共价连接的形式， 称为分子内的连接。
DNA连接酶的应用
体外连接DNA片段
通常有三类方法： • 第一种方法是以黏末端的方式连接，首先利用黏末端 的碱基互补退火形成切口，连接比较容易，效率也高， 是最常用的连接方式。 • 第二种方法是利用T4DNA连接酶以平末端的方式进行 连接。平末端连接反应要求高（酶量、ATP、温度等） 效率低，连接后其位点一般丢失，经常在无奈情况下 使用平末端的连接。 • 第三种方法是利用同聚物普尾、衔接物或人工接头等 对平末端进行修饰，最终以黏末端的方式连接。这类 方法虽然增加了连接作用的过程，但能体现黏末端连 接方式的长处。
T4 DNA ligase
5′P﹣ CCGAATTCGG﹣OH3′ 3′HO﹣GGCTTAAGCC﹣P5′
5´P﹣CCGAATTCGG 3´HO﹣GGCTTAAGCC EcoRⅠ 5′AATTCGG ′3 GCC
CCGAATTCGG﹣OH3´ GGCTTAAGCC﹣P5 ´
CCG3′ GGCTTAA5′
改造为黏末端进行连接
利用衔接物的连接
点评： 点评：
1、能够保留原酶切位点。 能够保留原酶切位点。 2、操作过程较繁。 操作过程较繁。 3、若外源DNA片段内含与衔接物 若外源DNA片段内含与衔接物 DNA 相同酶切位点会有影响。 相同酶切位点会有影响。
单链DNA的连接
T4 RNA ligase
可 催 化 单 链 DNA 或 RNA 的5′–磷酸与另一单链 DNA或RNA的3′–羟基之间 形成共价连接。
5´末端的磷酸基
3´，5´-磷酸二酯键
3´，5´-磷酸二酯键
3´末端的羟基
多核苷酸分子3´末端与5´末端的结构差别
小结DNA连接酶的作用特点
使双螺旋DNA的链间形成磷酸二酯键。 使双螺旋DNA的链间形成磷酸二酯键。 DNA的链间形成磷酸二酯键 要求在3 端有自由的－ 要求在3ˊ–端有自由的－OH，相邻的 端有自由的 OH， 端有磷酸。 5′–端有磷酸。 端有磷酸 需要能量，ATP或 需要能量，ATP或NAD﹢。
平末端的直接连接 点评： 点评：
1、简单、易行。 简单、易行。 2、连接效率低。 连接效率低。 3、原连接位点多为丢失。 原连接位点多为丢失。
连接方式（3） 同聚物加尾法的连接方式
DNA片段
dATP
5′﹣特异核酸外切酶
dTTP
末端脱氧核苷酰转移酶 AAAAAA TTTTTT TTTຫໍສະໝຸດ BaiduTTTT 混合、 混合、退火 聚合酶填补 连接酶封闭
AAAAAA
闭合、环状、双链 闭合、环状、 重组体
同聚物加尾法的连接
点评： 点评：
1、适用面广。 适用面广。 操作过程繁。 2、操作过程繁。 连接点大多丢失。 3、连接点大多丢失。
连接方式（4）
利用衔接物的连接
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC
5′P 3′ HO
OH3′ P5′
多核苷酸激酶
DNA片段的连接方式
粘末端的连接 平末端的连接 同聚物加尾法的连接 利用衔接物的连接
连接方式（1）
粘末端的连接（一般程序）：
1、选择具有单一切割位点的载体。 2、使用产生相同黏末端的酶分别切割 载体和外源DNA。 3、将载体与DNA片段混合退火。 4、用连接酶连接。
1、选择具有单一切割位点的载体。 2、使用产生相同黏末端的酶分别切 割载体和外源DNA。 3、将载体与DNA片段混合退火。 4、用连接酶连接。