荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
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__ 第二天丢弃洗液
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
常用的探针类型
CEP- Chromosome Enumerating Probe染色体计 数探针- 设计结合于特定染色体中的重复序列的 探针，以测定存在的拷贝数。
LSI- Locus Specific Identifier部位特异标识子设计结合于特定靶标区域或基因的部位的探针。 经常用于检测特定基因或特定区域的序列缺失或 扩增。
荧光原位杂交(FISH)技术的应用
云南省第一人民医院遗传诊断中心 唐新华
涂染探针分离
探针的标记
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸磷酸戊糖骨架
共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过 缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生 物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋 白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素 蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以 检测500bp的片段。
5. 将玻片移入2×SSC/ 0.1% NP-40（室温孵育）5 – 60 secs, 每张玻片轻摇1 – 3 secs.
6. 将玻片取出放在室温暗室，等到完全干燥 7. 将10 l的DAPI II到杂交区域(18mmsquare) ,避免气泡 8. 将玻片放在–20oC暗室至少30分钟后观察
离心，丢弃上清。 用KCl低渗液37℃水浴中低渗20 mins。
加0.8-2ml的新鲜固定液(3:1 甲醇：冰醋酸)轻轻混匀，离心5 mins 1,000 rpm并用1ml固定液重悬， 将样本存放-20 ℃至要做 FISH实验为止。
准备FISH滴片，将细胞悬液直接滴到冷玻片上，标上2个杂交 区域，每个区域大概15－25ul。（或者将玻片用冷的固定液浸 湿后滴片，然后放置72度水浴干燥），
FISH杂交仪
荧光显微镜
光源
滤光片： 一定波长 的光能通 过，其余 波长的光 滤掉，保 证只有需 要的荧光 被激发。
实验程序
样品染色体DNA变性 探针变性 杂交过夜 洗涤复染 显微观察
实验程序1 样本 收集
__AneuVysion kit主要用于培养后的以及未经培养的羊水 __样本必须按照ACT手册的推荐的方法收集 __样本收集必须要保证最小程度的母体细胞污染 __羊水最小需要量为2-5ml,这个依赖与孕周龄 __从收集羊水细胞到培养之间的间隔尽量要短（最晚
WCP-Whole Chromosome Painting 全染色体涂 染探针。能将24条染色体涂染上特异的颜色。
FISH的应用范围
一、染色体异常综合征（额外小染色体、微缺失 或重复等） 染色体涂染（chromosome painting） 基因或DNA片段的染色体定位 标记染色体（白血病、实体肿瘤等） 分子病理学（组织切片）
不能超过24小时） __注意，样本绝对不能放置冰箱以及冻存 __样本不能接触强酸强碱或者放置过热的环境，因为
上述会影响DNA而导致FISH实验的失败。 __血色或者棕色的样本不能用于检测，因为这些样本
已经被母体血液污染
实验程序2 未培养羊水细胞的制片及预处理
离心，丢弃上清。胶原蛋白酶或者胰蛋白酶trypsin处理，吹散 细胞团。 37℃水浴至少15-20分钟
实验程序5Leabharlann 显微镜下观察选择杂交最好的区域来观察结果 1. 用25X 的物镜扫描整个杂交区域 2. 选择分散较好的区域间期细胞重叠较少或
者分裂相较多的区域观察 3. 用40X 或者 100X物镜 开始从左到右从上到
下计数分析. 4. 计数50个细胞核。 5. 当出现10 – 60% 的嵌和体时，需要计数200
探针从–20 ℃中取出，温浴到室温， 用混匀器 混匀， 轻微离心，使得探针在管子底部，再 轻轻混匀，预变性了的探针可以直接加到片 子上杂交 。未变性的探针要73±1 ℃ 5mins 变 性探针再加到片子上杂交 。
橡胶水封片，42 ℃湿盒中杂交过夜。
实验程序4 洗脱 及复染
将0.4X SSC/ 0.3% NP-40在73±1oC 中预温 2. 将2X SSC/ 0.1% NP-40加入到另一个容器中，放于室温
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
常用的探针类型
CEP- Chromosome Enumerating Probe染色体计 数探针- 设计结合于特定染色体中的重复序列的 探针，以测定存在的拷贝数。
LSI- Locus Specific Identifier部位特异标识子设计结合于特定靶标区域或基因的部位的探针。 经常用于检测特定基因或特定区域的序列缺失或 扩增。
荧光原位杂交(FISH)技术的应用
云南省第一人民医院遗传诊断中心 唐新华
涂染探针分离
探针的标记
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸磷酸戊糖骨架
共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过 缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生 物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋 白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素 蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以 检测500bp的片段。
5. 将玻片移入2×SSC/ 0.1% NP-40（室温孵育）5 – 60 secs, 每张玻片轻摇1 – 3 secs.
6. 将玻片取出放在室温暗室，等到完全干燥 7. 将10 l的DAPI II到杂交区域(18mmsquare) ,避免气泡 8. 将玻片放在–20oC暗室至少30分钟后观察
离心，丢弃上清。 用KCl低渗液37℃水浴中低渗20 mins。
加0.8-2ml的新鲜固定液(3:1 甲醇：冰醋酸)轻轻混匀，离心5 mins 1,000 rpm并用1ml固定液重悬， 将样本存放-20 ℃至要做 FISH实验为止。
准备FISH滴片，将细胞悬液直接滴到冷玻片上，标上2个杂交 区域，每个区域大概15－25ul。（或者将玻片用冷的固定液浸 湿后滴片，然后放置72度水浴干燥），
FISH杂交仪
荧光显微镜
光源
滤光片： 一定波长 的光能通 过，其余 波长的光 滤掉，保 证只有需 要的荧光 被激发。
实验程序
样品染色体DNA变性 探针变性 杂交过夜 洗涤复染 显微观察
实验程序1 样本 收集
__AneuVysion kit主要用于培养后的以及未经培养的羊水 __样本必须按照ACT手册的推荐的方法收集 __样本收集必须要保证最小程度的母体细胞污染 __羊水最小需要量为2-5ml,这个依赖与孕周龄 __从收集羊水细胞到培养之间的间隔尽量要短（最晚
WCP-Whole Chromosome Painting 全染色体涂 染探针。能将24条染色体涂染上特异的颜色。
FISH的应用范围
一、染色体异常综合征（额外小染色体、微缺失 或重复等） 染色体涂染（chromosome painting） 基因或DNA片段的染色体定位 标记染色体（白血病、实体肿瘤等） 分子病理学（组织切片）
不能超过24小时） __注意，样本绝对不能放置冰箱以及冻存 __样本不能接触强酸强碱或者放置过热的环境，因为
上述会影响DNA而导致FISH实验的失败。 __血色或者棕色的样本不能用于检测，因为这些样本
已经被母体血液污染
实验程序2 未培养羊水细胞的制片及预处理
离心，丢弃上清。胶原蛋白酶或者胰蛋白酶trypsin处理，吹散 细胞团。 37℃水浴至少15-20分钟
实验程序5Leabharlann 显微镜下观察选择杂交最好的区域来观察结果 1. 用25X 的物镜扫描整个杂交区域 2. 选择分散较好的区域间期细胞重叠较少或
者分裂相较多的区域观察 3. 用40X 或者 100X物镜 开始从左到右从上到
下计数分析. 4. 计数50个细胞核。 5. 当出现10 – 60% 的嵌和体时，需要计数200
探针从–20 ℃中取出，温浴到室温， 用混匀器 混匀， 轻微离心，使得探针在管子底部，再 轻轻混匀，预变性了的探针可以直接加到片 子上杂交 。未变性的探针要73±1 ℃ 5mins 变 性探针再加到片子上杂交 。
橡胶水封片，42 ℃湿盒中杂交过夜。
实验程序4 洗脱 及复染
将0.4X SSC/ 0.3% NP-40在73±1oC 中预温 2. 将2X SSC/ 0.1% NP-40加入到另一个容器中，放于室温