DNA分子标记技术及其应用

DNA分子标记技术及其应用

摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA 分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。

关键词：分子标记；应用

分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。

1 DNA分子标记的概念

遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2 细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3 生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；

4 DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3 种标记是对基因的间接反映, 而DNA 分子标记是DNA 水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。

2 分子遗传标记技术的种类

2. 1 RFL P标记

RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记 ,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA 片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术) 实现的。

与传统的遗传标记相比,RFL P 标记具有下列优点:

(1)RF LP 标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；

(2)RFL P 标记等位基因间是共显性的,非等位基因间不存在上位效应,互不干扰；

(3) REL P起源于基因组DNA 的自然变异,这些变异在数量上几乎不受限制,可以选取足够数量能代表整个基因组的RFL P标记。RFLP标记正因为具有这些优点，其特别适用于构建遗传连锁图,在进行群体内和群体间的遗传变异度分析、群体间基因流的评价以及谱系亲缘关系分析时是强有力的工具。

2．2 RAPD技术

RAPD(Randem amplified polymorphic，RAPD是随机扩增多态性DNA)标记，是由美国科学家Willians等发展起来的,是以PCR 为基础的一项分子标记技术。它主要是以人工合成的随机寡聚核苷酸序列为引物,通常为10个碱基,利用PCR技术随机扩增基因组DNA模板的不同位点,得到一系列多态性DNA片段。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,经EB染色后,即可进行多态性分析。

RAPD标记与其它分子标记相比,其优点主要表现在:（1）RAPD 技术可以在对物种缺乏分子生物学研究资料的情况下,对其进行DNA 多态性分析；（2）RAPD 引物可用于不同生物基因组多态性的研究。因此,RAPD 引物可以在规模生产形成商品,这大大降低了研究费用。 RAPD 标记也有不足的一面,它为显性标记,检测的变异来源不清,也不能判断多态的DNA 片段为纯合子还是杂合子;此外,RAPD 标记的重复性常受实验条件的影响。

2．3AFLP技术

扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism , AFL P)标记是Zabeau等于1992年发明的一项专利技术。它是以PCR为基础的RFLP技术，基因组DNA经2个限制性内切酶酶切后(通常一个酶切点数多，另一个酶切点数较少) ，与特定接头相连接,根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，最后分离扩增的DNA片断。

AFLP既具有RAPD快速高效的特点,又具有RFLP稳定可靠、重复性好的特点,同时由于AFLP采用的专用引物3’端选择碱基数目和序列是随机的,故能提供比两者更多的DNA多态性信息,AFLP技术是一种功能强大但是技术难度最高的分子标记。

2．4 STS技术

STS ( Sequence - Tagged Sites，序列标记位点)标记是一种等位点的标记,在不同基因组间具有特异性,它是将RFLP标记技术转化为基于PCR的方法,通过设计一对长度约20 bp的特异引物,对基因组DNA进行扩增。该方法在设计引物时需要测序,但是,一旦获得引物, STS法就变得和RAPD一样简单、迅速。

2．5 SSR技术

SSR (Simple - Sequence Repeat,简单重复序列)标记,又称微卫星(microsatellite)标记,是利用特异引物扩增在植物基因组存在的由1～4个碱基组

成的简单重复序列 (SSR)等。由于微卫星的寡核苷酸的重复次数在同一种物种不同基因型个体之间差异性很大,多态性检出率高,而且操作简单,结果稳定可靠。所以,这一技术很快就发展为一种新的分子标记法,并在人类和小鼠中构建了以微卫星为主的遗传连锁图。

2．6 SNP标记

SNP( Simple Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)标记，被称为“第三代DNA遗传标记”，是直接以序列的变异作为标记的一种DNA分子标记。单核苷酸多态性是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、