出血性疾病的实验室检测2011课件
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• APTT被纠正 • 因子缺陷
抑制物
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1 mix 40s
• APTT不被纠正 • 抑制物存在
Mixing test 结果解释
aPTT results
Example
123
A -- normal plasma
30” 30” 30”
血小板聚集试验---原理
常用诱导剂诱导的血小板聚集
1. ADP 2. 胶原 3. 肾上腺素 4. 瑞斯托霉素
5. 花生四烯酸
正常人不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应
不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应 -----服用阿司匹林后
流式细胞仪的应用
• Bernard–Soulier syndrome GPIb-, GPIX-, and GPV-特异单克隆抗体
Built-In Printer LCD screen Soft keys
Trigger solution container Test Cartridge Cassette
Carousel
PFA-100® 检测原理
体内止血
endothelial cell collagen fibrils
vWF fibrinogen
ELISA
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
原理：
• 基于 APTT凝固法 • 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 • APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 • 制备标准曲线
FVIII:C检测
One-stage Factor VIII Assay
试剂因素：
– 磷脂 – 激活剂
•FX + FIXa/Ca2/PL+FVIIIa FXa +Substrate Peptide + pNa
•间接测定 (AT activity assay)
•（AT Heparin） + IIaresidual IIa + Substrate Peptide + pNa
发色底物法测定F VIII:C
• 商品化试剂盒 • 两步法的原理 • SSC ISTH推荐为高纯度FVIII:C测
定参比方法
凝固法和发色底物法
抑制物检测方法
• Bethesda法 • Nijmegen modification
狼疮抗凝物质检测
相关概念
aCL aPL β2GP1 LA
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 Β2-糖蛋白1
ELISA法检测抗心磷脂的抗体 抗体依赖或不依赖β2GP1
Leabharlann Baidu
因子缺陷敏感的APTT试剂
– 乏FVIII血浆
• 血友病A血浆 • 免疫吸附制备 • VWF含量正常
发色底物测定原理
发色底物测定原理
发色底物法分类
•直接一步测定
•FXa + Substrate Peptide + pNa (measured 405nm)
•直接两步测定 (Chromogenic FVIII)
BT
Col/Epi Col/ADP
Type 1 (n=36)
Type 2 (no 2N) (n=13)
Type 3 (n=4)
Acquired (n=5)
53% 85% 100% 80%
94%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
To : Meyer, Fressinaud et al.
Closure Time for Col/Epi (sec)
To : Meyer, Fressinaud et al.
PFA-100® Clinical Application
Sensitivity in vWD Type 1
Comparison of Bleeding Time (BT) and Closure Time (CT) in Type 1 vWD
B -- test plasma
90” 90” 90”
C -- test+normal (incubated) 35” 70” 70”
D -- test+normal (non-incubated) 35” 48” 70”
Example 1 – 因子缺乏 Example 2 – FVIII抑制物 Example 3 – 即刻反应抑制物
BT
CT
(min)
(s)
20 250
15
200
10
150
5
100
0
50
Epinephrine
ADP
To : Meyer, Fressinaud et al.
PFA-100® Clinical Application
Sensitivity for vWD - Overview
Bleeding Time vs PHC (Col/Epi and Col/ADP closure times)
platelet erythrocyte
lumen
PFA-100®
- 40 mbar
epinephrine or ADP
FLOW
aperture 150µm membrane collagen vWF
erythrocyte platelet
capillary 200µm
PFA-100® 检测原理
堵塞过程
出血性疾病的实验室诊断 瑞金医院
止血过程
Neural
BV Injury
Tissue Factor
Blood Vessel
Constriction
Reduced Blood flow
Platelet
Activation Primary hemostatic plug
Plt-Fusion
Coagulation
电镜检查
• 应用不同的电镜技术 • 可以分析血小板胞浆内的内容物和
颗粒 • 有助于血小板贮存池病和血小板释
放障碍的诊断
出血性疾病的检测
• 凝血因子缺陷症检测 • 抗凝物质增多检测 • 凝血因子抑制物检测 • VWD检测 • 血小板功能缺陷检测
IgG，IgM或IgA抗体，靶蛋白是心磷脂、 β2GP1或凝血酶原，靶蛋白与磷脂结合
抗心磷脂抗体与心磷脂结合的桥梁蛋白
狼疮抗凝物质 功能检测，抗β2GP1或凝血酶原抗体，使凝 血时间延长
狼疮抗凝物质(LA)检测
• 临床疑似APS • APTT延长 • 混合试验证实有抑制物存在 • 排除肝素导致的APTT延长
Mixing test 应用
初步判断： 1. 凝血因子缺陷 2. FVIII抑制物存在 3. 狼疮抗凝物质存在
凝血因子活性和抗原检测
• 活性测定 凝固点法
一步法 （One-Stage）---临床测定参比方法 两步法（Two-Stage）
发色底物法 （Chromogenic Factor VIII Assay） • 抗原测定
多聚体电泳
N
2A 2
2M
M
FVIII结合试验
FVIII activity
VWF:FVIII:B 2
1.5
1
0.5
0
0
0.2 0.4 0.6 0.8
1
1.2
dilution
× FVIINI结合P1 力P降4 低P8 P7
血小板功能异常性疾病
血小板功能检测
• 血小板计数 • 血涂片检查 • 血块收缩实验（血小板与Fb的相互
➢ 3个型（1型、2型、3型）
➢ 2型分为2A、2B、2M、2N四个亚型
VWD诊断
• FVIII:C • VWF:Ag • VWF:RCo • BT • PFA-100® • VWF多聚体检测 • 胶原结合试验 • FVIII结合试验
PFA-100® Platelet Function Analyzer
TT RT
检测方法
• ELISA法检测：
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 β2GPI 抗凝血酶原抗体
• 功能测定-凝固为基础的检测
用狼疮抗凝物质检测β2GPI-磷脂和/或凝血酶原-磷脂复合物 基于PT、APTT、dRVVT 的测定
血管性血友病（VWD）
VWD
➢ 血管性血友病因子（VWF）数量或者结构 异常引起
• Glanzmann thrombasthenia αIIb- 和 β3-特异性单克隆抗体
• Storage pool disease 5-羟色胺特异的单克隆抗体
血小板无力症流式检测结果
注：A. 先证者2的流式检测图（Ⅰ型 GT）；B. 先证者6的流式检测图（Ⅲ型 GT）。 横坐标：荧光强度；纵坐标：细胞数比率（％）。 红色曲线：正常人对照；蓝色曲线：患者。CD42b 用于设门
作用）
血小板功能检测
出血时间（BT)：血小板和血管功能
PFA-100® 检测
Sensitivity to Hereditary Platelet Defects
Data scatter of all study groups :
Closure Time for Col/ADP (sec)
300 250 200 150 100
50 0 0
Normals Glanzmann Bernard S. Giant Pl.S. Storage P.D.
50 100 150 200 250 300 Closure Time for Col/Epi (sec)
To : Müller, Kirchmaier et al. ; Frankfurt aM.
Activation
Thromibn, Fibrin
Stable Hemostatic Plug
出血性疾病的诊断流程
凝血因子缺陷症检测
凝血途径
Fg，TT
血友病筛选及诊断试验
筛选试验
• PT • APTT • TT • Fg
确诊试验
纠正
混合试验
凝血因子活性检测 病理性抗凝物质检测
不纠正 FVIII抑制物
类肝素
狼疮抗凝物质
混合试验(mixing test)
• PT延长＞3′， APTT延长＞5′ • 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 • 即刻检测，37°C孵育2h后检测 • 结果判断： ＞X+2SD 不纠正
Mixing test 结果判断
因子缺陷
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1mix 32s
PFA-100® 临床应用
诊断VWD
Data scatter of all study groups :
300
Closure Time for Col/ADP (sec)
250
Normals
200
vWD Type 1
150
vWD Type 2
100
vWD Type 3
50
0
0
50 100 150 200 250 300
抑制物
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1 mix 40s
• APTT不被纠正 • 抑制物存在
Mixing test 结果解释
aPTT results
Example
123
A -- normal plasma
30” 30” 30”
血小板聚集试验---原理
常用诱导剂诱导的血小板聚集
1. ADP 2. 胶原 3. 肾上腺素 4. 瑞斯托霉素
5. 花生四烯酸
正常人不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应
不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应 -----服用阿司匹林后
流式细胞仪的应用
• Bernard–Soulier syndrome GPIb-, GPIX-, and GPV-特异单克隆抗体
Built-In Printer LCD screen Soft keys
Trigger solution container Test Cartridge Cassette
Carousel
PFA-100® 检测原理
体内止血
endothelial cell collagen fibrils
vWF fibrinogen
ELISA
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
原理：
• 基于 APTT凝固法 • 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 • APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 • 制备标准曲线
FVIII:C检测
One-stage Factor VIII Assay
试剂因素：
– 磷脂 – 激活剂
•FX + FIXa/Ca2/PL+FVIIIa FXa +Substrate Peptide + pNa
•间接测定 (AT activity assay)
•（AT Heparin） + IIaresidual IIa + Substrate Peptide + pNa
发色底物法测定F VIII:C
• 商品化试剂盒 • 两步法的原理 • SSC ISTH推荐为高纯度FVIII:C测
定参比方法
凝固法和发色底物法
抑制物检测方法
• Bethesda法 • Nijmegen modification
狼疮抗凝物质检测
相关概念
aCL aPL β2GP1 LA
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 Β2-糖蛋白1
ELISA法检测抗心磷脂的抗体 抗体依赖或不依赖β2GP1
Leabharlann Baidu
因子缺陷敏感的APTT试剂
– 乏FVIII血浆
• 血友病A血浆 • 免疫吸附制备 • VWF含量正常
发色底物测定原理
发色底物测定原理
发色底物法分类
•直接一步测定
•FXa + Substrate Peptide + pNa (measured 405nm)
•直接两步测定 (Chromogenic FVIII)
BT
Col/Epi Col/ADP
Type 1 (n=36)
Type 2 (no 2N) (n=13)
Type 3 (n=4)
Acquired (n=5)
53% 85% 100% 80%
94%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
To : Meyer, Fressinaud et al.
Closure Time for Col/Epi (sec)
To : Meyer, Fressinaud et al.
PFA-100® Clinical Application
Sensitivity in vWD Type 1
Comparison of Bleeding Time (BT) and Closure Time (CT) in Type 1 vWD
B -- test plasma
90” 90” 90”
C -- test+normal (incubated) 35” 70” 70”
D -- test+normal (non-incubated) 35” 48” 70”
Example 1 – 因子缺乏 Example 2 – FVIII抑制物 Example 3 – 即刻反应抑制物
BT
CT
(min)
(s)
20 250
15
200
10
150
5
100
0
50
Epinephrine
ADP
To : Meyer, Fressinaud et al.
PFA-100® Clinical Application
Sensitivity for vWD - Overview
Bleeding Time vs PHC (Col/Epi and Col/ADP closure times)
platelet erythrocyte
lumen
PFA-100®
- 40 mbar
epinephrine or ADP
FLOW
aperture 150µm membrane collagen vWF
erythrocyte platelet
capillary 200µm
PFA-100® 检测原理
堵塞过程
出血性疾病的实验室诊断 瑞金医院
止血过程
Neural
BV Injury
Tissue Factor
Blood Vessel
Constriction
Reduced Blood flow
Platelet
Activation Primary hemostatic plug
Plt-Fusion
Coagulation
电镜检查
• 应用不同的电镜技术 • 可以分析血小板胞浆内的内容物和
颗粒 • 有助于血小板贮存池病和血小板释
放障碍的诊断
出血性疾病的检测
• 凝血因子缺陷症检测 • 抗凝物质增多检测 • 凝血因子抑制物检测 • VWD检测 • 血小板功能缺陷检测
IgG，IgM或IgA抗体，靶蛋白是心磷脂、 β2GP1或凝血酶原，靶蛋白与磷脂结合
抗心磷脂抗体与心磷脂结合的桥梁蛋白
狼疮抗凝物质 功能检测，抗β2GP1或凝血酶原抗体，使凝 血时间延长
狼疮抗凝物质(LA)检测
• 临床疑似APS • APTT延长 • 混合试验证实有抑制物存在 • 排除肝素导致的APTT延长
Mixing test 应用
初步判断： 1. 凝血因子缺陷 2. FVIII抑制物存在 3. 狼疮抗凝物质存在
凝血因子活性和抗原检测
• 活性测定 凝固点法
一步法 （One-Stage）---临床测定参比方法 两步法（Two-Stage）
发色底物法 （Chromogenic Factor VIII Assay） • 抗原测定
多聚体电泳
N
2A 2
2M
M
FVIII结合试验
FVIII activity
VWF:FVIII:B 2
1.5
1
0.5
0
0
0.2 0.4 0.6 0.8
1
1.2
dilution
× FVIINI结合P1 力P降4 低P8 P7
血小板功能异常性疾病
血小板功能检测
• 血小板计数 • 血涂片检查 • 血块收缩实验（血小板与Fb的相互
➢ 3个型（1型、2型、3型）
➢ 2型分为2A、2B、2M、2N四个亚型
VWD诊断
• FVIII:C • VWF:Ag • VWF:RCo • BT • PFA-100® • VWF多聚体检测 • 胶原结合试验 • FVIII结合试验
PFA-100® Platelet Function Analyzer
TT RT
检测方法
• ELISA法检测：
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 β2GPI 抗凝血酶原抗体
• 功能测定-凝固为基础的检测
用狼疮抗凝物质检测β2GPI-磷脂和/或凝血酶原-磷脂复合物 基于PT、APTT、dRVVT 的测定
血管性血友病（VWD）
VWD
➢ 血管性血友病因子（VWF）数量或者结构 异常引起
• Glanzmann thrombasthenia αIIb- 和 β3-特异性单克隆抗体
• Storage pool disease 5-羟色胺特异的单克隆抗体
血小板无力症流式检测结果
注：A. 先证者2的流式检测图（Ⅰ型 GT）；B. 先证者6的流式检测图（Ⅲ型 GT）。 横坐标：荧光强度；纵坐标：细胞数比率（％）。 红色曲线：正常人对照；蓝色曲线：患者。CD42b 用于设门
作用）
血小板功能检测
出血时间（BT)：血小板和血管功能
PFA-100® 检测
Sensitivity to Hereditary Platelet Defects
Data scatter of all study groups :
Closure Time for Col/ADP (sec)
300 250 200 150 100
50 0 0
Normals Glanzmann Bernard S. Giant Pl.S. Storage P.D.
50 100 150 200 250 300 Closure Time for Col/Epi (sec)
To : Müller, Kirchmaier et al. ; Frankfurt aM.
Activation
Thromibn, Fibrin
Stable Hemostatic Plug
出血性疾病的诊断流程
凝血因子缺陷症检测
凝血途径
Fg，TT
血友病筛选及诊断试验
筛选试验
• PT • APTT • TT • Fg
确诊试验
纠正
混合试验
凝血因子活性检测 病理性抗凝物质检测
不纠正 FVIII抑制物
类肝素
狼疮抗凝物质
混合试验(mixing test)
• PT延长＞3′， APTT延长＞5′ • 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 • 即刻检测，37°C孵育2h后检测 • 结果判断： ＞X+2SD 不纠正
Mixing test 结果判断
因子缺陷
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1mix 32s
PFA-100® 临床应用
诊断VWD
Data scatter of all study groups :
300
Closure Time for Col/ADP (sec)
250
Normals
200
vWD Type 1
150
vWD Type 2
100
vWD Type 3
50
0
0
50 100 150 200 250 300