下调极光激酶A活性抑制Hep2细胞的促血管生成作用和迁移、侵袭能力

1182上海交通大学学报（医学版）2018, 38 (10)明与AURKA有关的功能学改变、作用机制将为临床以AURKA为喉癌基因治疗靶点提供实验依据，因而具有重要的临床意义。

实体肿瘤的生长伴随着血管生成的刺激，包括但不限于血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）[11]。

VEGFA结合于受体酪氨酸激酶VEGFR2（VEGF receptor 2），触发多种信号转导通路，从而调节血管内皮细胞反应，控制血管生成[12]。

肿瘤的进展与其诱导血管生成的能力密切相关。

若肿瘤未能成功诱导血管生成，高速增殖的肿瘤细胞也将增速凋亡，从而使细胞进入休眠状态[13]。

在肿瘤，尤其是喉癌中，有关AURKA与血管生成的作用研究甚少。

本研究在前期对AURKA激活喉癌休眠细胞研究的基础上，从另一种休眠机制——血管生成休眠入手，初步探讨喉癌细胞中AURKA与血管生成的作用关系。

1材料与方法1.1 材料1.1.1细胞株人喉癌细胞株Hep2细胞源于一位男性原发性喉癌患者，低分化，由上海市消化外科研究所保存并传代；人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical veinendothelial cells，HUVEC），源于临床脐带静脉所得血管内皮细胞，由上海市消化外科研究所保存传代。

1.1.2主要试剂胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、Western blotting一抗稀释液购自上海碧云天公司；高效蛋白裂解液RIPA购自北京索莱宝公司；磷酸酶抑制剂 protease inhibitor cocktail购自美国Cell Signaling Biotechnology公司；BCA蛋白测定试剂盒、Restore抗体剥离缓冲液购自美国Thermo Fisher Scientific公司；磷酸化AURKA（p-AURKA）兔抗人单克隆抗体、AURKA兔抗人单克隆抗体、VEGFR2兔抗人单克隆抗体、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗购自美国Cell SignalingTechnology公司；VEGFA兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司；鼠抗人β肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体购自上海康成生物公司；VX680（AURKA抑制剂）购自美国Selleck公司；ECL 超敏发光液购自美国Millipore公司；Matrigel® Basement Membrane Matrix购自美国Corning公司。

1.2 方法1.2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养Hep2细胞和HUVEC细胞，并放置在条件为5%CO2、37 ℃的培养箱中培养。

1.2.2 CCK8细胞增殖试验用胰酶消化对数生长期的Hep2细胞，计数后均匀接种到96孔板（细胞密度为1×103/孔），100 nmol/L的VX680分别培养细胞0（空白对照组）、24、48 h。

吸出原有培养液，每孔加入含10 μL/mLCCK- 8试剂的培养液2 mL，培养箱培养1～2 h，酶标仪测吸光度值，绘制细胞增殖曲线。

1.2.3血管生成试验准备并制备基质胶，预冷实验用品并在冰上操作。

将提前过夜融化的基质胶均匀铺于48孔板，每孔100 μL，不要留有气泡，37 ℃孵育30～60 min，待胶凝固。

胰酶消化HUVEC，进行细胞计数，每孔加入4×104个细胞，用Hep2细胞培养上清液37 ℃孵育6 h，观察成管情况并拍照。

1.2.4 Transwell迁移、侵袭试验取VX680培养0、24、48 h的细胞消化并计数，Transwell上室加入200 μL无血清细胞悬液（调整细胞浓度为4×104/孔），下室加入600 μL 含10%FBS的DMEM培养液，培养箱培养48 h，0.1%结晶紫固定并染色30 min后，清洗晾干，显微镜下拍照并计数。

侵袭试验区别于迁移试验的地方在于，需要在Transwell上室内加入1:6或1:7稀释的基质胶以模拟细胞外基质且培养时间短于迁移试验。

1.2.5Western blotting RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸，-80 ℃保存蛋白样品。

配胶后上样，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，300 mA转膜2 h，5%牛血清白蛋白室温封闭1～2 h。

剪膜，孵育一抗（1:1 000）（p-AURKA、AURKA、VEGFA、VEGFR2），4 ℃摇床过夜。

次日TBST 10 min×3次洗膜，室温孵育二抗2 h（1:10 000），TBST 10 min×3次洗膜。

ECL超敏发光液显影，Image J软件量化显影结果，分析p-AURKA、AURKA、VEGFA、VEGFR2蛋白表达情况。

1.3 统计学分析所有数据采用x—±s表示，应用GraphPad Prism 7.0软件进行数据处理和作图，且采用单因素方差分析统计分析数据，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果2.1 VX680抑制p-AURKA蛋白表达100 nmol/L浓度的VX680持续作用于Hep2细胞0、24、48 h，Western blotting检测p-AURKA、AURKA及β-actin的蛋白表达。

结果显示：VX680作用Hep2细胞48 h，p-AURKA表达水平显著降低（图1A）；与对照细胞（0 h）相比，差异有统计学意义（P=0.000）（图1B）。

11832.3 下调p-AURKA 后喉癌血管生成减少VX680持续作用于Hep2细胞0、24、48 h 后，收集上清液，HUVEC 细胞铺板，血管生成试验观察不同处理条件下细胞的成管能力。

结果显示：VX680作用Hep2细胞48 h 的培养上清液中HUVEC 细胞的血管生成能力降低（图3A ），成管数及节点数均减少；与对照组细胞相比，差异有统计学意义（P =0.000）（图3B ）。

注：A. VX680作用于Hep2细胞不同时间，Western blotting 检测p-AURKA 蛋白表达水平；B. p-AURKA 相对蛋白表达量统计图（①P =0.000，与0 h 比较）。

图1 VX680抑制p -AURKA 蛋白表达Fig 1 Inhibition of VX680 on the expression of p-AURKA protein2.2 下调p-AURKA 后Hep2细胞中VEGFA 、VEGFR2蛋白表达下降100 nmol/L 浓度的VX680作用于Hep2细胞0、24、48 h ，Western blotting 检测VEGFA 、VEGFR2及β-actin 的蛋白表达。

结果显示，VX680作用Hep2细胞48 h ，VEGFA 、VEGFR2表达水平下降（图2A ），与对照细胞（0 h ）相比，差异有统计学意义（P =0.000）（图2B ）。

注：A.VX680作用于Hep2细胞不同时间，Western blotting 检测VEGFA 、VEGFR2蛋白表达水平；B. VX680抑制VEGFA 、VEGFR2蛋白表达的统计图（①P =0.000，与0 h 相同指标比较）。

图2 VX680抑制VEGFA 和VEGFR2蛋白表达Fig 2Inhibition of VX680 on the expression of VEGFA and VEGFR2 protein注：A. VX680作用于Hep2细胞不同时间的培养上清液对HUVEC 细胞成管能力的影响（×100）；B.VX680抑制血管生成的成管数及节点数统计图（①P =0.000，与对照组相同指标比较）。

图3 VX680抑制喉癌血管生成Fig 3Inhibition of VX680 on angiogenesis in laryngeal cancer2.4 下调p-AURKA 后Hep2细胞增殖、迁移、侵袭能力降低全光谱微孔分光光度计测量吸光度D （450 nm ），结果显示，Hep2细胞在未加VX680的DMEM 培养液中近对数生长，而在加入VX680的DMEM 培养液中细胞增殖于48 h 显著降低，与同时点对照细胞相比，差异有统计学意义（P =0.000）（图4A ）。

Transwell 迁移、侵袭试验中，VX680持续作用Hep2细胞48 h ，细胞迁移、侵袭能力显著下降，与0 h 相比，差异有统计学意义（P =0.000）（图4B 、C ）。

AAABBB张钰涵，等 下调极光激酶A 活性抑制Hep2细胞的促血管生成作用和迁移、侵袭能力1184上海交通大学学报（医学版）2018, 38 (10)3 讨论本研究结果显示，VX680抑制喉癌Hep2细胞中AURKA 的磷酸化，VEGFA 及其受体VEGFR2的蛋白表达降低，血管生成减少；提示了AURKA 激活肿瘤休眠细胞的可能机制。

AURKA 在细胞周期调节中的重要作用及其小分子抑制剂的运用使其有望成为抗癌治疗的有效靶点[14]。

继发现第1种AURKA 抑制剂ZM447439作为癌症靶向治疗的潜在药物后，已陆续在癌症治疗中引入30余种AURKA 抑制剂[14]。

本实验采用阻断多种人类肿瘤细胞周期进程的AURKA 抑制剂VX680。

研究发现，VX680是一种有效的AURKA 选择性小分子抑制剂，可抑制体内肿瘤的生长[15]，在肺癌[16]、乳腺癌[17]、宫颈癌[18]等肿瘤细胞的研究中均有应用。

研究者分别在应用VX680抑制AURKA 后，研究了肿瘤细胞的周期、凋亡、侵袭及化学治疗敏感性变化，但对AURKA 和血管生成这一与肿瘤复发转移息息相关的因素之间的关系却研究甚少。

血管生成是指已有血管壁细胞的出芽和随后的稳定过程[19]，在肿瘤生长这一具有高度侵袭性的过程中，伴随着血管扩张和血管通透性的变化[20]。

血管生成亦可以使肿瘤细胞经血流向远处传播，是肿瘤生长、转移的基础[21]。

在此过程中，VEGF 家族和受体酪氨酸激酶介导促血管生成活性[22]。

有关血管生成在肿瘤发生、发展中的作用，在其他肿瘤中早有发现。

Lu 等[23]的实验研究了ARHI 这一抑癌基因，其中，生长因子和血管生成因子及细胞基质蛋白可以阻碍ARHI 诱导的自噬性细胞死亡。

Romain 等[24]在神经母细胞瘤中，研究了AURKA 这一癌基因与血管生成的关系。

本研究着重探讨了在喉癌细胞中，AURKA 促进血管生成的作用；同时发现抑制AURKA 后，Hep2细胞的增殖及迁移、侵袭能力亦降低。

在肿瘤研究中，确定肿瘤迁移、侵袭能力及其潜在机制，与癌症诊断、预后、药物开发和治疗新策略息息相关[25]。