骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤大鼠神经功能的影响_万兴

３．ＢＭＳＣｓ的标 记 取 第 三 代 生 长 良 好，９０％ 融合的细胞，弃去培养液，加入无血清 ＤＭＥＭ 培养 液置于３７℃、体积分 数 为 ５％ ＣＯ２饱 和 湿 度 的 培 养 箱过夜培养。弃去培养基。用移液器取 ４０ｍｌ １０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培 养 液 置 于 ５０ｍｌ试 管 中 ，再 向 内 加入２５０μｌ的 ＳＰＩＯ、３０μｌ的 ＰＬＬ 混 合，室 温 震 荡 ４０ｍｉｎ，使得 ＦＢＳ、ＰＬＬ、ＳＰＩＯ 最终浓度分别为 １０％、 ０．７５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ，将 ＰＬＬ－ＳＰＩＯ 液按照４ｍｌ／瓶， 分别加入细胞培养 瓶 中，使 得 每 个 细 胞 培 养 瓶 中 含 有４ｍｌ培养液，置 于 ３７℃、体 积 分 数 为 ５％ ＣＯ２ 饱 和湿度的培养箱中共培养４８ｈ。取 ＰＬＬ－ＳＰＩＯ 液共 孵育４８ｈ后的 ＢＭＳＣｓ，移 液 管 吸 去 瓶 内 培 养 液 后， 加入 ＰＢＳ洗涤 ２ 遍。４％ 多 聚 甲 醛 固 定 １０ｍｉｎ 后， 蒸馏水冲洗 ２ 遍。 进 行 普 鲁 士 蓝 染 色 ：６％ 稀 盐 酸 与２％ 的 亚 铁 氰 化 钾 等 体 积 混 合 溶 液 孵 育 ３０ｍｉｎ， 光学显微镜下观察细胞铁颗粒的分布情况并计算 标记率。
江 苏 医 药 ２０１４ 年 ５ 月 第 ４０ 卷 第 ９ 期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｍａｙ ２０１４，Ｖｏｌ ４０，Ｎｏ．９
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将标记的 ＢＭＳＣｓ移 植 到 ＴＢＩ大 鼠 的 脑 内，通 过 进 行改良神经功能损伤严 重 程 度 评 分 （ｍＮＳＳ）观 察 大 鼠的神经功能恢 复 情 况，行 ＭＲＩ观 察 ＢＭＳＣｓ的 迁 移及分布 情 况，从 而 探 讨 ＢＭＳＣｓ对 脑 组 织 损 伤 的 修复作用。现将结果报道如下。
创伤性颅脑损伤（ＴＢＩ）是 中 枢 神 经 系 统 的 常 见 病，其病死率较高 。 ［１］ 脑损伤引起神经元、胶质 细 胞 及脑内血管 的 破 坏，导 致 神 经 功 能 障 碍 。 ［２］ 骨 髓 间
基 金 项 目 ：江 苏 省 自 然 科 学 基 金 （ＢＫ２０１０４１９） 作 者 单 位 ：２１０００９ 江 苏 省 ，东 南 大 学 附 属 中 大 医 院 神 经 外 科 通 讯 作 者 ：王 文 宏 Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｗｅｎｈｏｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ＴＢＩ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ；Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄ ［Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｍａｙ ２０１４，４０（９）：１００６－１０１０．］
材料与方法
一 、材 料 １．实验动 物 提 取 ＢＭＳＣｓ 选 择 清 洁 级 健 康 ＳＤ 雄性大鼠２只，体重 １００－１２０ｇ；ＴＢＩ模 型 建 立 选 择清洁 级 健 康 成 年 ＳＤ 雄 性 大 鼠 ６０ 只，体 重 ２５０－ ３００ｇ，均由东南大学医学院动物实 验 中 心 提 供。 实 验过程中对动物 处 置 参 照 国 家 科 技 部 ２００６ 年 发 布 的 《关 于 善 待 实 验 动 物 的 指 导 性 意 见 》。 ２．试 剂 及 仪 器 ＤＭＥＭ 培 养 基 和 胎 牛 血 清 （ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司），胰 蛋 白 酶 （Ｓｉｇｍａ公 司 ），单 克隆抗体 ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０（武 汉 博 士 德 生 物工 程 有 限 公 司 ），磷 酸 盐 缓 冲 液 （ＰＢＳ）（Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公 司 ），左 旋 多 聚 赖 氨 酸 －超 顺 磁 氧 化 铁 （ＰＬＬ－ＳＰＩＯ） （Ｓｉｇｍａ公 司 ），多 聚 甲 醛 （上 海 凌 峰 化 学 试 剂 有 限 公 司），亚铁氰化钾（天 津 市 凯 通 化 学 试 剂 有 限 公 司 ）； ＨＥＰＡ Ｃｌａｓｓ １００ 型 ＣＯ２ 培 养 箱 （Ｔｈｅｒｍｏ 公 司 ）， ＳＷ－ＣＪ－１Ｆ 型 超 净 工 作 台 （苏 州 净 化 设 备 厂），ＦＡＣ－ ＳＣａｌｉｂｕｒ流式 细 胞 仪 （ＢＤ 公 司 ），倒 置 相 差 显 微 镜 （Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２６ＸＰ 高 速 冷 冻 离 心 机 （Ｂｅｃｋｍａｎ公司），ＸＢ．Ｋ．２５ 细 胞 计 数 板 （上 海 求 精 公司），动物脑立体 定 位 仪 （成 都 仪 器 厂），以 上 仪 器 由 东 南 大 学 医 学 院 外 科 实 验 室 提 供 ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ ７．０Ｔ 核磁共振扫描仪（布鲁克公司），由东南大学分 子影像与功能影像重点实验室提供。 二 、方 法 １．ＢＭＳＣｓ的 分 离 和 培 养 取 健 康 清 洁 级 ＳＤ 雄性大鼠２只，体重１００－１２０ｇ腹 腔注射 ２％ 戊巴比 妥钠过量麻醉致死，体积分数 为 ７５％ 的 乙 醇 中 全 身 浸泡消毒１０ｍｉｎ。分离 股 骨、胫 骨，用 ＤＭＥＭ 细 胞 培 养 液 冲 出 骨 髓 ，将 细 胞 悬 液 用 细 胞 筛 进 行 过 滤 ，收 集过滤液 行 １０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ｍｉｎ，然 后 制 成 骨 髓 单细胞悬液，加入含１０％ ＦＢＳ的 低 糖 ＤＭＥＭ 培 养 基的２５ｍｌ的培养瓶 中，置 于 ３７℃、５％ ＣＯ２饱 和 湿 度的培养箱中。孵育４８ｈ后 全量更换培养 基，以 后 ７２ｈ全量换液１ 次。 待 贴 壁 细 胞 生 长 至 ８０％－９０％ 融合时，用０．２５％胰酶消化，按 １∶２ 的 比 例 进 行 传 代培养。 ２．ＢＭＳＣｓ鉴 定 取 生 长 良 好 的 贴 壁 ９０％ 左 右
的第三代细 胞，０．２５％ 胰 酶 消 化，４℃ 以 １０００ｒ／ｍｉｎ 离心５ｍｉｎ，用 ＰＢＳ 制 成 细 胞 悬 液 （含 细 胞 ２×１０６ 个／ｍｌ），将细胞悬液１００μｌ分装至８只 ＥＰ 管中，分 别加入 单 克 隆 抗 体 ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０，每 个 样品设 立 同 型 阴 性 对 照 （阴 性 对 照 组 不 加 任 何 抗 体），充 分 吹 打 均 匀，４℃ 避 光 孵 育 ４０ｍｉｎ。 待 反 应 结 束 后 ，用 ＰＢＳ洗 涤 细 胞 ３ 次 以 除 去 未 结 合 抗 体 ， １％ 多 聚 甲 醛 固 定１５ｍｉｎ后 运 用 流 式 细 胞 仪 进 行 检 测分析。
ＭＲＩ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｉｅｄ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｂｙ ＨＥ ｄｙｅｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｕｓｓｉａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＰＬＬ－ＳＰＩＯ ２５μｇＦｅ／ｍｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ＢＭＳＣｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ １００％ ．Ｔｈｅ ｍＮＳＳ ｓｃｏｒｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｏｎ ｔｈｅ ３ｒｄ，７ｔｈ ａｎｄ １４ｔｈ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ＴＢＩ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ＳＰＩＯ－ｌａｂｅｌｅｄ ＢＭＣＳｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｏ ｍｉｇｒａｔｅ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ａｒｅａ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｉｅｄ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｐｕｓ ｃａｌｌｏｓｕｍ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔ ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＭＳＣｓ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
【关 键 词 】 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ；创 伤 性 颅 脑 损 伤 ；干 细 胞 移 植 ；超 顺 磁 性 纳 米 铁 颗 粒 【中 图 分 类 号 】 Ｒ６５１ 【文 献 标 识 码 】 Ａ 【文 章 编 号 】 ０２５３－３６８５（２０１４）０９－１００６－０５
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ＷＡＮ Ｘｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｗｅｎｈｏｎｇ，ＦＡＮ Ｘｉｎｘｉｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，ＣＨＩＮＡ
充质干细胞 （ＢＭＳＣｓ）是 一 种 具 有 多 向 分 化 潜 能 的 干细胞［３］。Ｒｉｔｆｅｌｄ等［４］发现 将 ＢＭＳＣｓ移 植 到 脊 髓 损伤模型大鼠，ＢＭＳＣｓ可以使脊髓再生并产生 新 的 神经组织及血管。那么，ＢＭＳＣｓ是否能够促进 损 伤 脑组织的修复呢？
我们 通 过 培 养 ＢＭＳＣｓ并 对 其 进 行 标 记，然 后
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江 苏 医 药 ２０１４ 年 ５ 月 第 ４０ 卷 第 ９ 期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｍａｙ ２０１４，Ｖｏｌ ４０，Ｎｏ．９
·论著·
骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤
大鼠神经功能的影响
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万 兴 王文宏 樊欣鑫
【摘要】 目的 研究骨髓间充质干细 胞 （ＢＭＳＣｓ）移 植 对 颅 脑 损 伤 大 鼠 神 经 功 能 的 影 响 。 方 法 分离、纯化大鼠 ＢＭＳＣｓ，并用左旋多聚赖氨酸－超顺磁性纳米铁颗粒（ＰＬＬ－ＳＰＩＯ）复合 物 对 ＢＭＳＣｓ进 行标记。采用改 良 Ｆｅｅｎｅｙ法 制 成 创 伤 性 颅 脑 损 伤 大 鼠 模 型 ６０ 只，随 机 均 分 为 两 组。实 验 组 在 脑 损 伤部位的对侧立体定向移 植 ＰＬＬ－ＳＰＩＯ 标 记 的 ＢＭＳＣｓ；对 照 组 注 入 等 量 的 生 理 盐 水。 在 移 植 后 第 １、３、７、１４和２８天时 采 用 改 良 神 经 功 能 损 伤 严 重 程 度 评 分 （ｍＮＳＳ）对 各 组 大 鼠 进 行 评 分 ；然 后 行 ＭＲＩ扫描，观察脑实质内的信号变化及 ＢＭＳＣｓ在脑内的迁移情况。应用组织学检查，观察脑损伤部 位的 病 理 变 化。 结 果 含 量 为２５μｇ Ｆｅ／ｍｌ的 ＰＬＬ－ＳＰＩＯ 培 养 液 能 成 功 标 记 ＢＭＳＣｓ（标 记 率 为 １００％）。实验组大鼠在细胞移植后的第３、７、１４ 天 时 ｍＮＳＳ 低 于 对 照 组 （Ｐ＜０．０５）；移 植 后 第 ７ 天， ＢＭＳＣｓ从植入部位沿胼胝体向脑损伤区域迁移并分布于损伤区域。结论 脑内立体定向移植 ＢＭＳＣｓ 能明显促进创伤性颅脑损伤大鼠神经功能的恢复。
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ） ｏｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ（ＴＢＩ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｐｏｌｙ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）ａｎｄ ＳＰＩＯ．Ｔｈｅ ＴＢＩ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅ－ｆａｌｌｉｎｇ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｅｅｎｅｙ ｉｎ ６０ ｍａｌｅ ＳＤ ｒａｔｓ，ｗｈｉｃｈ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｅｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ＰＬＬ－ＳＰＩＯ－ｌａｂｅｌｅｄ ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃａｌｌｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ＴＢＩ ｓｉｄｅ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ｉｎｓｔｅａｄ ｏｆ ＢＭＳＣｓ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ｍＮＳＳ）ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｔｈｅ １ｓｔ，３ｒｄ，７ｔｈ，１４ｔｈ ａｎｄ ２８ｔｈ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ＴＢＩ．Ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＩＯ－ｌａｂｅｌｅｄ ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ