3酶、细胞、原生质体固定化

交联反应既能发生在分子间，也可发生
在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保
持溶解状态。
• 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为
不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团
被交联，酶活力损失大。
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用
带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、
化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接
固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法 3)包埋法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是 一种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌 体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然 保持活性，长期使用酶活力不减少。
最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温 度也上升（有例外）。
（四）酶的最适pH
带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。
Relative activity (%)
70 60 50 40 30 20 10 0 5 6 7 pH 8 9 A B
与固定化酶相比，固定化细胞的情 况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
三、固定化酶（细胞）的评价指标
(一)酶(细胞)的活力
固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定
自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定
化酶。
(二) 蛋白总量
1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法
1.固定化酶(immobilized enzyme)
固定在载体上并在一定空间范围内进行催 化反应的酶。
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
优点：
(1)可提高稳定性。
(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。
缺点：
(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。
(2)酶活性下降。
高，酶易流失 高
再生 费用
可能 低
可能 低
不变
不能 低
不变
不能 高
可变
不能 中等
可变
底物专一性 不变
（二）细胞的固定化方法
1.固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式 固定化细胞
细胞类型 微生物
植物 动物
生理状态 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器
活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
2. 固定化方法
生物识别元件 (Biological recognition element)

是酶、抗原(体)、细胞器、组织 切片和微生物细胞等生物分子经固定 化后形成的一种膜结构，对被测定的 物质有选择性的分子识别能力。
换能器(Transducer)
将识别元件上进行的生化反应中
2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间范围内进行
生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
TEMED
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子 微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几 百微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透 膜孔径的小分子底物和产物可以自由进 出，被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白
酶的抵抗力增加。
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形；
②抑制酶的自身降解。
③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶
的侵袭。
如：氨基酰化酶， 70℃，15分钟，酶失去活性。 而固定化后， 70℃，15分钟，有>80%活性。
（三）酶的最适温度
ß －D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O2
Glucose Membrane Glucose oxidase Oxygen
Gluconic acid
Hydrogen peroxide
Electrode
根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量， 可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。
3.固定化原生质体
意义：
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
物理 吸附法
离子交 换吸附
一、在工业生产上的应用
1. 氨基酰化酶（Aminoacylase）
世界上第一种工业化生产的固定化酶 乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
A-L-Ala A-D-Ala
固定化 酶柱子
离心机
泵 储 罐 反应产物
L-Ala A-D-Ala
消 旋 反 应 器
晶体 L-Ala
微生物细胞
吸附法
植物细胞 动物细胞
吸附力较弱， 细胞易脱落
包埋法



实验：
2.4%左右的卡拉胶 ，70 ℃溶解, 再冷却到 42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃）
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
（三）原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。
酶的高级结构，酶活回收率高。
•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
吸附法
物理吸附法 离子吸附法 易 中等 易 弱
包埋法 共价结 交联法 合法
较难 强 高 难 强 低 较难 强 中等
制备难易 结合程度 活力回收
（五）酶的动力学特征
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电 性能变化。
固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的 表观Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的 表观Km值显著增加。
（六）酶的作用专一性
与自然酶基本相同。但大分子底 物难于接近酶分子，导致酶的专一性 发生改变。
二、固定化细胞的性质
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。 •酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：重氮化法、
叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻
易脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶
的空间构象而影响酶的催化活性。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
天然凝胶
包埋条件 酶活性
不变
强度
差
温和 琼脂、海藻酸钙、 角叉菜胶、明胶
合成凝胶
聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
海藻酸钙凝胶包埋法：
滴至 海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中 角叉菜胶包埋法： 滴至 角叉菜胶＋E (or cell) 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： Acr+ Bis+E (or cell) AP KCl 溶液中 IE (or IC) IE(or IC)
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解 吸附。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling） 借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交
联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
继酶传感器（enzyme sensor）后，又出现：

细胞器传感器（cell organelle sensor）
组织传感器（tissue sensor）
微生物传感器（microbe sensor）
免疫传感器（immunosensor）
1）酶传感器的原理

生物传感器
由生物识别单元（如酶、微生物、 抗体等）和物理转换器相结合所构成的 分析仪器。
Biosensor •Sensitive and specific • Rapid • Simple
1967年Updike等采用酶的固定化 技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜 上，然后再和氧电极结合，组装成了 世界上第一个生物传感器——葡萄糖 氧化酶电极。