单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）

单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）

作者 l Frank Tao

编辑 l 细胞房间

摘要：随着单克隆抗体技术发展，单克隆CHO细胞株筛选技术也日异月新，越来越高效，越来越智能化。本文主要结合自身CHO细胞株开发和细胞培养经验，将目前国内外单克隆抗体CHO细胞株筛选技术进行总结，供行业内参考，促进行业健康发展；

问题：如何4-6个月内，筛选到稳定的单克隆细胞株表达在3-5 g/L或以上？

关键词：单克隆抗体；CHO细胞；ClonePix；单克隆影像学拍照；Beacon；

1.宿主细胞

抗体药物生产的宿主细胞主要NS0、HEK293、Hybridoma、SP2/0、CHO等，但CHO细胞是生产抗体药物应用最广的宿主细胞，CHO细胞类型也比较多，例如：DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S 等。上世纪八九十年代开始，工业上使用较早的是DHFR体系（二氢叶酸还原酶缺陷型）DG44细胞。当细胞培养基内还有MTX（甲氨蝶呤）时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带齐上下100-1000kb的基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可以提高目的蛋白的表达量。现在很多单抗生产的体系依然是DG44。

GS体系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1是近些年发展的一种基因扩增筛选系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛地认可。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的

氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源的谷氨酰胺培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵（MSX），可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要在：该系统不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株做为宿主细胞；CHO-K1细胞易于培养，更强壮；在培养基中无需加谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，并且可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。

当然，目前也有商业化的GS缺陷性CHO细胞，主要有lonza公司的CHOK1SV（2002年）和CHOK1SVGS-KO（2012年），Merk 公司（原SAFC）的CHOZN CHO K1（2006年），采用缺陷的GS体系筛选可以缩短单克隆筛选周期，但由于供应商收费昂贵，国内外很多公司依然选择ATCC原始的CHO K1宿主细胞。

2.筛选标记以及表达载体选择

表-1 哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记

Table-1 Selectable markers often used in mammalian expression

筛选标记筛选试剂

代谢型筛选标记（扩增型基因筛选标记）二氢叶酸还原酶（DHFR）甲氨蝶呤（MTX）谷氨酰胺合成酶（GS）

氨基亚砜蛋氨酸

（MSX）

抗生素筛选标记（非扩增型基因筛选标记）嘌呤霉素抗性

（Puromycin acetyltransferase）

嘌呤霉素

（Puromycin）

杀稻瘟霉素脱氨酶（Blasticidin

deaminase ）

杀稻瘟霉素

（Blasticidin ）组氨醇脱氢酶（Histidinol dehydrogenase）

组氨醇

（Histidinol）

潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase）

潮霉素

（Hygromycin）

氯林可霉素耐药基因（Zeocin resistance gene ） 氯林可霉素

（Zeocin ）

博来霉素耐药基因（Bleomycin resistance gene ） 博莱霉素

（Bleomycin ）

氨基糖苷磷酸转移酶（Aminoglycoside phosphotransferase ）

新霉素（Neomycin or G418）

以上表格是统计了目前哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记，随着GS 体系优越性，越来越多的公司选择采用GS 筛选标记。

商业中所选择Vector 供应商主要是Life technologies 公司的，从pcDNA3系列到现在Freedom pCHO1.0，其大小由原来的4000-5000kp 到现在的近13000kp 。Freedom pCHO1.0是Life technologies 在2012年开发的一个vector ，大小有12988bp （见下图），具有以下特点：(1)目的基因的轻链和重链可以同时插入一个vector 上面，以前的vector 设计多数是插入一个轻链或者重链；（2）它在可插入的轻链或者重链的前面设计的启动子在CMV 基础上分别进行较大的改善；（3）它具有两个筛选标记，以前的vector 仅仅设计了一个筛选标记。

图-1 Freedom pCHO1.0图谱

Figure-1 Freedom pCHO1.0 profile

由于vector是细胞株筛选非常关键的一个环节，很多公司具有自主知识产权的vector，当然在密码子、启动子等元件会做很多优化和工作，最终得到一个高表达的vector。

同时，在信号肽选择方面，也是非常关键，通常很多公司会采取现有应用于单克隆抗体药物信号肽专利，将几个专利中的信号肽进行初步筛选适合于自己项目的信号肽。也有大型公司开发属于自主知识产权的信号肽。

3.转染方法

常用于哺乳动物细胞转染方法：磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和电穿孔法，在工业界使用最多的应该电穿孔法，它是通过物理电流细胞膜形成瞬时孔洞，DNA沿孔洞进入细胞，随机整合细胞染色体。

另外，随着技术的发展，也有定点整合技术，即DNA直接定点整合到CHO细胞染色体某一位点，但由于技术成熟度以及项目的差异性，还未在工业界广泛推广使用。

4.单克隆筛选技术

CHO细胞转染之后，通常会加压一段时间做一个clone pool或者minipool，然后进行单克隆筛选。结合笔者经验，主要简单介绍Puromycin、G418、MTX以及MSX等筛选压力原理及浓度范围。

筛选标记原理

Puromycin 它为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除puromycin毒性的

作用。

G418 它是一种氨基糖苷类抗生素，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂之一。

MTX 它为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制 DHFR的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。文献报道称，随着MTX浓度的增加，

绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基