第八章 层析
薄层层析法
2 展开操作
展开操作是在密闭的容器中进行的,根据薄层板的 大小，选择不同的层析缸，配好展开剂，将展开剂 （一般2-10mL）倒入层析缸，密闭放置一定时间， 待层析缸被展开剂饱和后（目的是防止边缘效应的 产生），再迅速将薄层板放入（注意：切勿使溶剂 浸没样品点，展开剂浸入薄层高度约0.5mm即 可），密闭，展开即开始。当溶剂移动到接近薄板 上端边缘时，取出薄板，画出溶剂前沿。
1、吸附剂
薄层层析最常用的吸附剂有氧化铝和硅胶等， 由于吸附剂的吸附能力有强有弱,吸附力弱的 对化合物的吸附就不甚牢固。这就是吸附层 析能分离不同物质的基本原理之一。
吸附力强弱与吸附剂本身的性质和被吸附的 化合物的性质有关。
吸附剂：吸附剂的选择常是分离工作成败 的关键，对吸附剂的选择与要求和吸附柱层 析相同。要求小于250目,并要求粒度均匀。 用于薄层层析的吸附剂或予制薄层一般活度 不宜过高，以Ⅰ-Ⅲ级为宜，而展开距离则 随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细展开 距离相应缩短。一般不超过10cm。否则可
第八章 色谱分离技术 第四节 薄层层析法
薄层色谱法（Thin-Layer chromatography. 简写 TLC）是一种简便、快速、微量的层析 方法，一般是将某种吸附剂或支持剂均匀地 铺在玻璃板上,形成一个薄层而进行层析的一 种方法。广泛地用于化学成分的分离、精制、 定性鉴定和含量测定。其原理与柱层析基本
选择展开剂的原则是:若被分离的成分亲水性较强时，则 展开剂的极性也应较强。反之，成分亲脂性强，而展开 剂的亲脂性亦应较强。
层析名词解释
层析名词解释层析（Diffusion），是指物质从高浓度区域向低浓度区域自发流动的过程。
它是一种重要的物质传输方式，广泛应用于生物学、化学、物理学等领域的研究中。
层析过程的实现需要以下几个关键要素：1. 被分离物质的混合物：通常由多种不同组成的物质混合而成，需要进行分离。
2. 层析柱：提供分离材料的载体，通常是一个空心管子，内壁涂有吸附材料。
3. 层析介质：填充在层析柱内部的材料，其特性决定了被分离物质的分离效果。
4. 流动相：通过层析柱的流体，能够使被分离物质在层析介质中传输。
层析根据不同的分离机制可以分为几种类型：1. 吸附层析：基于物质在固体表面的吸附性质进行分离。
层析介质通常是一种多孔结构的固体，吸附分离的程度取决于物质和固体之间的亲和性差异。
吸附层析广泛用于制药、化学工程等领域的分离纯化过程中。
2. 离子层析：利用物质之间的电荷差异进行分离。
层析介质通常是带电基团的树脂，吸附和解吸过程通过改变流动相的盐浓度来调节。
离子层析常用于核酸、蛋白质等生物大分子的纯化。
3. 凝胶层析：利用分子在凝胶基质中的渗透性差异进行分离。
凝胶通常是一种交联的高分子物质，通过控制凝胶孔径大小和交联程度来实现不同分子的分离。
凝胶层析广泛应用于蛋白质、核酸等大分子的富集和纯化过程中。
层析的分离效果受多种因素影响，如流动相的流速、吸附介质的性质、温度等。
为了提高层析的分离效率，常常采用多级层析（多个层析柱串联）或亲和层析（利用结合剂和配体之间的特异性相互作用进行分离）。
此外，还可以通过改变流动相的性质（如pH值、离子浓度等），加大以某一组分为目标的分离效果。
总的来说，层析是一种重要的分离技术，具有良好的选择性和灵活性，在生物学、化学等领域中被广泛应用于分离和纯化过程中，对于研究和生产具有重要意义。
离子交换层析的基本操作
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
子交换层析的基本原
理 离子交换介质的基本性 质 离子交换介质的选择原
则 离子交换层析的基本操 作
离子交换层析的基本原理
目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定； 使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合； 使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。
(2) 样品进柱
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出
然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来
亲和层析（affiuity chromatography）
原理：
a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利 用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技 术。
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的基本性 能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物
如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离 子起交换作用
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
层析的原理和应用
层析的原理和应用1. 层析的概念和基本原理层析（Chromatography）是一种将混合物中的组分分离和提纯的技术方法。
它基于组分之间在固定相和流动相之间的相互作用力的不同，使各种组分在系统中以不同速度迁移，达到分离的目的。
层析技术广泛应用于化学、生物、环境等领域。
层析技术的基本原理是利用流动相在固定相上的移动来实现物质的分离。
固定相通常是具有一定吸附性或分配性的材料，如硅胶、纸张、亲水性基质等。
流动相则是将待分离的混合物溶解在溶剂中，通过与固定相的相互作用，使各组分在固定相上以不同速率迁移。
2. 层析技术的分类和应用层析技术根据其基本原理和操作方式的不同，可以分为多种类型。
以下是其中几种常见的层析技术及其应用：2.1 薄层层析法（TLC）薄层层析法是一种在薄层材料上进行的层析技术。
常用的薄层材料包括硅胶和氧化铝等。
它具有简单、快速、经济的特点，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
2.2 柱层析法柱层析法是将固定相填充在柱中，通过流动相沿着柱内固定相的分布，实现各组分的分离。
根据固定相的不同，柱层析法又可分为凝胶柱层析和高效液相层析等。
柱层析法在药物分离纯化、天然产物提取、有机合成等领域具有广泛应用。
2.3 气相层析法（GC）气相层析法是将待分离的混合物蒸发为气体状态，通过在柱中固定相的分离，最终使各组分在检测器上进行定性和定量分析。
气相层析法广泛应用于石油化学、环境监测、食品安全等领域。
2.4 液相层析法（LC）液相层析法是将待分离混合物溶解于液相，在柱中利用固定相进行分离。
液相层析法根据流动相的不同，可分为常压液相层析和高效液相层析等。
液相层析法在制药、生物、环保等领域具有广泛应用。
2.5 离子层析法（IC）离子层析法是利用不同组分之间的化学亲合性进行分离的一种层析技术。
它广泛应用于水质分析、环境监测、生物学研究等领域，尤其是对离子的分析具有很高的选择性和灵敏度。
3. 层析技术的优点和局限性层析技术具有许多优点，使其成为众多分析方法中的重要手段。
chapter8亲和层析-文档资料
基质的选择 可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）
琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、 纤维素。
最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
8.3 亲和色谱介质
8.3.1 亲和配基 酶的抑制剂 A蛋白 辅酶和磷酸腺苷 过渡金属离子 肝素
抗体 凝集素
色素配基 组氨酸
间隔臂
当配基的分子量较小时，将其 直接固定在载体上，会由于载 体的空间位阻，配基与生物大 分子不能发生有效的亲和吸附 作用，如图7-14a所示。 如果在配基与载体之间连接间 隔臂，可以增大配基与载体之 间的距离，使其与生物大分子 发生有效的亲和结合。
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核 糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系， 都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力 称为亲和力。
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
第八章离子交换、吸附与层析分离设备
缺点：
设备数量较多，操作管理较为复杂
（三）连续式离子交换设备
一般连续式离子交换设备 优点：
树脂利用率高，生产周期短 交换速度快，产品质量均匀 连续化生产便于自动化控制
缺点：
树脂破损很大 设备及操作较复杂且不易控制
压力流动连续式离子交换设备
由再生洗涤塔和交换塔组成 优点：
能连续生产、供液不间断，而且效率高 树脂利用率及再生饱和程度高，因而再生液耗量较省 操作管理较为方便
一、吸附过程与原理
固体吸附剂可分为非多孔和多孔性物质两类：
非多孔性固体具有很小的比表面积 而多孔性固体由于其颗粒内存在着微孔，比表面可以很大
常用吸附剂
活性炭
优点：吸附能力强，分离效果好，来源比较容易，价格比较便宜 缺点：很难控制标准，而且色黑质轻，容易污染环境
硅胶
优点：杂质少，品质稳定，耐热耐磨性好，而且可以按需要的形状，
离子交换树脂的性能评价 交换容量
交换容量是单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离 子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数，是表征树脂交换能力 的主要参数 。
其表示方法有重量交换容量和体积交换容量两种，后一种较直观 的反映生产设备的能力。
测定方法 ：
阳离子树脂：滴定NaOH 阴离子树脂：滴定氯离子
离子交换树脂的性能评价 滴定曲线
分别向几个大试管中加入1g氢型（或羟型）离子交换剂，其中一个试管加入 50ml 0.1mol／L的NaCl溶液，其他试管亦加入相同体积的溶液，但含有不同 量的0.1mol／L的NaOH（或HCl），使其发生离子交换反应。强酸（碱）性离 子交换剂放置24ｈ，弱酸（碱）性离子交换剂放置７日。达到平衡后，测定 各试管中溶液的pH值。以每克干离子交换剂加入的NaOH（或HCl）为横坐标， 以平衡pH值为纵坐标作图，就可得到滴定曲线。
分配层析
七、分配色谱法的应用
分配色谱适用于分离极性比较大、在有机溶剂 中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。 若所分离的化合物的极性基团相同和类似，但 非极性部分（化合物的母核烃基部分）的大小 及构型不同，或者所分离的各种化合物溶解度 相差较大，或者所分离的化合物极性太强不适 于吸附色谱分离时，可考虑采用分配色谱法。 分配色谱法多用于分离亲水性的成分，如苷类、 糖及氨基酸类
三、溶剂系统 分配层析用的溶剂系统种类很多，一般针 对欲分离物质的性质来选择：被分离的物 质是亲水性强的化合物，溶剂系统的极性 亦较强；被分离的物质是亲脂性强的，则 洗脱溶剂的亲脂性也要相对加强。 通常用的溶剂系统中固定相是极性大的溶 剂，如水缓冲溶液、甲醇、甲酰胺、丙二 醇、甘油等。流动相则为亲脂性溶剂，有 亲脂性较强和亲脂性较弱的等。一般可采 用氯仿、正丁醇、异丁醇、正戊醇、甲酚、 吡啶等，也可用不同比例的混合剂。
3、pH 样品的pH同滤纸和展开剂一样，都是纸层 析中很重要的条件，都会影响到Rf值和分 离后斑点的形状、拖尾现象等。对各种不 同的成分有不同的要求。 4、温度 温度如果改变，就会使水中展开剂的溶解 度也改变，所以Rf值也改变。一般最好在 10-15℃之间进行层析，温度改变最好不超 过±0.5℃：最好在恒温箱中进行。
一、操作步骤:
1、装柱: 分配柱层析的装柱比吸附柱层析麻烦一些，但十 分重要，直接影响分离效果。 装柱前，将固定相与载体混合，如果用硅胶、纤 维素等载体时，可以直接称出一定量固体，再加 入一定比例的固定相液体，混匀后按吸附剂装柱 法装入。装柱也分干法和湿法两种。 应注意的是：因为分配柱层析法使用两种溶剂， 所以事先必须先使这两个相互相饱和，即将两相 溶剂放在一起振摇，待分层后再分别取出应用。 至少流动相应先用固定相饱和后再使用；否则， 在以后洗脱时当通过大量的流动相时，就会把载 体中的固定相逐渐溶掉．最后只剩下载体，就不 成为分配色谱了。
10第八章-生物制药工艺学-离子交换
功能基团:
与载体共价结合 的固定的活性基团
平衡离子:
与功能基团 以离子键联结 可移动的活性离子
平衡离子带正电荷的为阳离子交换树脂，带负电荷者称阴离子交换树脂。
在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂。
一、离子交换树脂的分类
强酸型树脂：功能基团 为磺酸根(-SO3H)及甲基 磺酸根(-CH2SO3H)，有 好的解离能力。
❖ 在特定溶液条件下，电荷密度、电荷种类不同
4
基本原理
❖ 离子交换法：利用溶液中带电粒子与离子交换
剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。 ❖ 带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。 ❖ 离子交换是可逆的。
5
离子交换剂
❖ 离子交换剂：由惰性的不溶性载体、功能基团和平 衡离子组成。
❖ 阳离子交换剂：平衡离子带正电荷。 ❖ 阴离子交换剂：平衡离子带负电荷。
（3）多孔性，表面积大、交换容量大，分离效率 高，回收率高，可用于分离和制备。
（4）设备简单，操作不复杂，应用广泛。 （5）树脂具有再生能力，可反复使用。
❖ 缺点：
分离周期长，耗时过多。
离子交换技术是分离精制生化药物的重要手段
17
第二节 离子交换树脂的结构和种类
离子交换剂
平衡离子 决定树脂正负
不溶性载体:
Sample application and wash
--
-
+
+ -+
-+
++-
离子交换法过程
洗脱Elution
-
-
-
-
-
-
-
-
+ --
层析名词解释生物化学
层析名词解释生物化学
嘿，咱今儿个就来好好唠唠层析这个在生物化学里超重要的玩意儿！
你知道不，层析就好比是一场神奇的分离大冒险！比如说，咱把一
堆乱七八糟的混合物放进去，就像把各种颜色的糖果混在一起。
然后呢，通过层析这个魔法过程，就能把它们一个一个地分离开来，清楚
得很呢！就像你能清楚地挑出红色糖果、蓝色糖果一样。
想象一下，这就像是一场赛跑，不同的物质在层析的跑道上奔跑，
速度不一样，跑的路径也不一样，最后就各自到达了不同的终点，被
我们清楚地分辨出来啦。
这多有意思呀！
在生物化学的世界里，层析可是大功臣呢！科学家们用它来分离蛋
白质呀、核酸呀这些重要的生物分子。
比如说，要研究某个蛋白质的
结构和功能，就得先把它从复杂的混合物里分离出来呀，这时候层析
就派上大用场啦！“哎呀，没有层析可咋办呀！”
咱再举个例子哈，要是没有层析，就好像你在一堆杂物里找一个小
小的戒指，那可太难啦！但有了层析，就像是有了一双神奇的手，帮
你把戒指一下子就挑出来啦。
总之呢，层析在生物化学里那绝对是不可或缺的存在呀！它让我们
能更深入地了解生物分子的奥秘，为生物科学的发展立下了汗马功劳呢！我觉得呀，层析真的是太神奇、太重要啦！以后肯定还会有更多
更厉害的应用呢！。
第八章层析
层 析分 类
2. 固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸层析法、薄层层析法和柱层析法
纸层析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于大量制备分离，是主要的层析
分离手段。
层 析分 类
3. 压力
在以固体为固定相的液相柱层析中，根据操作压力的不同，分为低压(压力一般小于0.5MPa)、中
2.阻滞因数Rf ：
基本概念
Rf 流溶动质相的的迁迁移移速＝ 速率 同率一溶 时质 间的 流迁 动移 相距 的 距离 迁 离移
溶质的迁移距离＝ V
＝V
能进行分配的有效 积截A面m＋kd As
流动相的迁移距AV离 m ＝Rf
Am Am＋kd
As
基本概念
3.洗脱体积VR ：溶质达最大浓度时，已流出的流动相体积， VR＝Vm＋kdVs 滞留时间：溶质流出色谱柱所需的时间 tR＝VR/Qe t0＝Vm/Qe Qe:洗脱剂的流量 t0：死时间
C B A A+B
层 析分 类
5.分离操作方式 :顶替展开 又称置换，排代展开，利用一种与固定相作用力极强的置换剂作流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分
子。优点是浓缩，单位柱长固定相的利用率最高。但各组分一个连一个的流出，界线不明，分离不理想 ；合适的置换剂不易找到。
D
A
B
D：置换剂
层 析分 类
压(压力为0.5～4.OMPa)和高压(压力为 4.0～40MPa)液相层析法；
高压液相层析法中层析介质(固定相)微细，分离精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制备
分离常用低压或中压液相层析法。
层 析分 类
4.流动相的流动方向 轴向流层析； 径向流层析：溶质在半径方向上得到分离
层析原理与技术课件
++
Equilibration
Sample Application
+ + +- +++
+
-
+ + +- + ++
++ + ++
+
+++
- + ++
++ +
++
Sample Adsorption
+
+ +
+
++
+
+ +
+
++
+ ++ + ++
+
+ +
+
+
+ +
+
++
++
-
-
--
-
Elution
+
+ +
+
第15页/共54页
高 疏水作用
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的应用
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的
蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的 蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 • 2.脱盐
第16页/共54页
1 34 2.00 1.75
1.50 pH 6.0
生化技术第八章 聚焦层析
pH
pH
6
6
pH
7 pH8
pH
pH
6
6
Байду номын сангаас
pH9
pH8
pH7
pH6
柱中的pH变化：
高→梯度形成→梯度下移→梯度消失（低）
2.蛋白质行为
蛋白质存在于“风云变幻”的层析柱中。
（1）环境pH＜蛋白质pI时，蛋白质带正电荷，不 与阴离子交换剂结合，以很快的速度向前移动；
（2）当在某一距离时，环境pH＞蛋白质pI，蛋白 质带负电荷，并与阴离子交换剂结合；
柱内发生何种变化？
中和作用—多缓冲液中的大部分酸性成分与与阴离子交 换剂的碱性基团结合。 结果：随淋洗过程的进行，柱内每一点的pH都在下降； 一段时间后，柱内自上而下形成了pH6-9的梯度。
pH9
一
起
段
始
时
间
后
pH9
pH6 pH9 pH9
最后，继续淋洗，pH梯度逐渐下移，直至底部流出液 pH由9 降至6 并恒定于此值时，柱中的pH梯度随即消 失。
4. 加样和洗脱 洗脱液浓度和洗脱体积可参考表8-2 ，控制流速在3040cm/h
5.样品中多缓冲剂的去除 固体硫酸铵法使蛋白质沉淀，与多缓冲剂分开； 通过Sephadex G-25柱可把大于5000Da的蛋白质与 多缓冲剂分开； 通过亲和层析和疏水层析把蛋白质与多缓冲剂分开
2. 多缓冲交换剂的选择与处理
根据pH梯度范围确定多缓冲交换剂与起始缓冲液。
起始缓冲液的pH要比pH梯度上限高约0.4个pH 单位，以克服因起始缓冲液与洗脱液之间pH差值引 起的pH波动。
3. 样品的准备 加样量：通常每10ml床体积可以加100mg左右的样品 样品浓度: 由于有聚焦效应，样品浓度可低些
层析的概念和分类
层析的概念和分类
层析（chromatography）是一种利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，用于分离混合物中的各个组分。
层析系统由两个相组成：固定相和流动相。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同。
随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
根据不同的分类标准，层析可以分为多种类型：
1. 根据固定相的形式，层析可以分为柱层析和平板层析。
柱层析是待分离物质在柱状固定相中进行的层析分离技术，而平板层析则是在平板型固定相中进行的分离技术。
2. 根据流动相的组成，层析可以分为有机层析和无机层析。
有机层析是利用有机溶剂作为流动相的层析技术，而无机层析则是利用无机溶剂或无机盐溶液作为流动相的层析技术。
3. 根据分离原理，层析可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅化学书籍或咨询化学专家。
层 析PPT演示课件
主要机理是分子筛效应,当被分离物质 流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在 凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组 分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
3
色谱历史 古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）
1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现 代色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)
层析
CHROMATOGRAPHY
1
掌握：层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求
熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质
了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存
2
一.概述
层析Chromatography(色谱),利用混合 物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解 度、分子极性、分子大小、分子形状、吸 附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持 物上集中分布在不同区域，借此将各组分 分离。
10
.离子交换层析 （ion-exchange chromatography ） ----利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和
力不同而进行层析分离的方法。
.凝胶层析（gel chromatography） ----利用不同组分之间分子大小不同，在通过
凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进 行分离的方法。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
反相层析
• 层析柱的平衡 ，一般用流动相A对层析柱进行 充分的平衡。
㈢ 流动相的选择和准备
• 乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中 一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢 固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异 丙醇等；
• 溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用 溶剂中的稳定性是须考虑的因素；
• 分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水 相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相；
胍、0.1%的SDS等具良好耐受能力 各种肽、蛋白质、寡聚核苷酸等分析和制备型分离纯化 （二）μRPC C2/C18 （多孔硅胶微粒为基质 ）
在有机溶剂中稳定性较好，但pH稳定范围较窄，仅能 在pH2～8范围内使用，对变性剂、去污剂等试剂具良好 的耐受，操作温度范围4～40℃
粒径小，适合肽谱分析和极微量纯化过程 （三）Sephasil Protein / Sephasil Peptide
流动相组成
• 影响层析过程的容量因子和选择性，从而对 分辨率产生影响
• 一般由水、有机溶剂、酸、离子对试剂（ion pairing agent）等组成： 有机溶剂又称为修饰剂（modifier），其 作用是降低流动相极性；酸的加入是调节pH 至酸性范围内，有助于抑制离子化作用，包 括抑制溶质的酸性基团和硅胶介质的硅醇基 发生解离；离子对试剂是通过离子作用与溶 质分子结合，引起溶质疏水性质的改变从而 调节溶质的保留行为。
的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或 添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定 的影响 ） • 对于能产生荧光的物质，使用荧光监测 器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。 • 此外，视差折光检测器、电导检测器等 也都能用于层析样品的在线检测。
层析柱的再生、清洗和贮存
层析的名词解释
层析的名词解释层析（chromatography）是“色层分析”的简称。
利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。
有吸附层析、分配层析两种。
一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。
层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。
层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
语源学chroma意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。
色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
层析（色谱）chromatography在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。
用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。
将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均匀的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography），后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析，即在固定相的一端，点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入，移动接近另一端。
通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。
当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。
也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直），使各成分分离完全的双向层析（two-dimensional chromatography）。
层析技术
质也可以是固定在固
离的物质朝着一定方
体物质上的液体物质。 向移动的液体或气体。
这些物质能与待分离
柱层析中的流动相一
的化合物进行可逆的
般称为洗脱剂。它也
吸附、溶解与交换作
是层析中的重要影响
用，对分离混合物起
因素之一。
着关键作用。
流动相在推动固定相中的混合物朝一个方 向移动是，由于混合物中各组分的理化性 质（吸附力、溶解度、分子形状和大小、 分子极性、分子亲和力等）的差异，各组 分受固定相的阻滞作用和受流动相的推动 作用各不相同，在层析柱中移动速度也不 同，从而使混合物中结构上只有微小差异 的组分分离开来。
2、析法的特点
(1)分辨力高 (2)分析效率高 (3)灵敏度高 (4)应用广泛 局限性：在定量分析中需要纯制得标准物
质；不能精确地解决物质的化学结构问题
二.层析技术的分类
1. 按流动相的形式不同
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液 液-固
相
以液体作为流动相
层 液-液
析
2.按层析的原理可分为
样品
流 动 相
大分子
较快流出
2.凝胶层析的介质
凝胶是一种多孔网状结构物质。层析用的 凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目 数来表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗 粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效 果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。 一般常用的是100~200目。
目前常用的有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂 糖凝胶，丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺葡聚 糖凝胶以及Superdex
在实际工作中，可根据被分离的物质的性质，选 用适当类型的离子交换剂。分离碱性蛋白质常用 阳离子交换剂，分离酸性蛋白质常用阴离子交换 剂。分离蛋白质样品时一般常用弱型交换剂。
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素）/kg干树脂；当抗菌素浓度为 0.082 kg/m3时，吸附量为 0.043kg/kg。假定吸附属朗格谬尔 等温吸附，求料液含抗菌素0.3 kg/m3时的吸附量。
三、设计题
设计利用离子交换剂分离一种含等 电点分别为4.0，7.5，9.0的蛋白质 混合液的方案，并简述理由。
混合液中，A和B均为含有葡萄糖链 的糖蛋白，其pI分别为5.0和5.5， 而C和D分子质量分别为40000和 50000，试设计层析分离它们的方案。
最大吸附量为70（mg/cm 吸附剂）。 当溶液含酶50（mg/L）时，吸附量 为最大吸附量的一半。现有含酶浓 度220（mg/ L）的原料液1.5（L）， 若要获得溶质90％的回收，试问应 加入多少纤维素？
且吸附等温线遵循朗格谬尔规律， 吸附常数K＝2.2×10-5 mol/m3。现有 含酶量4×10-3 mol/m3的该种酶液， 拟用葡聚糖树脂吸附分离1.5 m3该种 酶液，若要实现95％的吸附提取率， 求所需的吸附剂量。
6.简述亲和层析的分辨率比一般吸 附层析高的原因。
它们与固定相的作用力依次增强 （即A<B<C），试分别绘出采用洗脱 展开法置换展开和前流展开法的流 出曲线图。（图1～3）
二、计算
附分离类固醇，吸附平衡方程q＝ 0.68C0.38（kg吸附质/kg吸附剂）， 已知发酵液类固醇含量0.58kg/m3， 发酵液量2m3，应用8kg和72000， 已知A和B分别含有组氨酸残基和含 有葡萄糖链的糖蛋白，而C为普通的 蛋白质，试设计一种分离这三种蛋 白质的方案。
第八章 层析
一、简答
1.色谱分离法的特点是什么？
2.色谱分离法的原理是什么？
3.装好的层析柱，在上样前，应先 用2～3倍量的洗脱剂进行平衡，平 衡的主要目的时什 么？
4.为什么疏水色谱可在高盐浓度下 吸附？
白质能否在 Sephadex G-75柱中分 开？为什么？已知Sephadex G-50的 分离范围为1500～30000Da； Sephadex G-75的分离范围为3000～ 80000Da；Sephadex G-100的分离范 围为4000～150000Da。