细胞损伤模型
MPP诱导SHSY5Y细胞慢性损伤帕金森病模型的建立及鹿茸多肽的保护作用
MPP诱导SHSY5Y细胞慢性损伤帕金森病模型的建立及鹿茸多肽的保护作用1. 本文概述本文旨在探讨MPP（1甲基4苯基吡啶离子）诱导SHSY5Y细胞慢性损伤帕金森病（Parkinsons Disease, PD）模型的建立，并研究鹿茸多肽（ Velvet Antler Peptides, VAP）对SHSY5Y细胞的保护作用。
帕金森病是一种慢性进展的中枢神经系统变性疾病，主要表现为中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，导致纹状体多巴胺含量降低，进而引发一系列临床症状。
MPP作为一种常用的诱导剂，可以模拟PD 病理过程中的氧化应激和线粒体损伤，因此在PD的研究中广泛应用。
在本研究中，我们首先通过MPP处理SHSY5Y细胞，建立一种稳定、可靠的PD细胞模型。
SHSY5Y细胞是一种人源神经母细胞瘤细胞系，具有多巴胺能神经元的某些特性，因此常被用作研究PD的体外模型。
我们将评估MPP处理对SHSY5Y细胞的存活率、形态变化、细胞凋亡以及多巴胺能神经元标志物的表达等方面的影响，从而验证模型的有效性。
随后，我们将研究鹿茸多肽对MPP诱导的SHSY5Y细胞损伤的保护作用。
鹿茸多肽是从鹿茸中提取出的一种生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物活性。
我们将通过添加不同浓度的鹿茸多肽，观察其对MPP损伤细胞的存活率、细胞凋亡以及氧化应激水平等指标的影响，从而评估其保护作用及其机制。
本文的研究结果将为深入了解PD的发病机制以及寻找新的治疗策略提供有益的参考。
同时，也为鹿茸多肽在神经退行性疾病治疗中的应用提供实验依据。
2. 材料与方法本研究选用人类神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株作为实验模型。
细胞由细胞库提供，并在实验室中进行扩增培养。
细胞培养基为含有10胎牛血清(FBS)、1青霉素链霉素的DMEM培养基，于37C、5 CO2的条件下进行培养。
为了建立慢性损伤的帕金森病模型，我们使用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶（MPP）作为神经毒素。
细胞损伤模型
细胞损伤模型一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16 mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。
选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。
3H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
LPS致肝细胞损伤模型的建立研究
LPS致肝细胞损伤模型的建立研究作者：滕芳芳胡晓斐刘晨晨等来源：《安徽农业科学》2014年第04期摘要[目的]探索LPS体外致人Chang Liver细胞损伤模型的建立方法和意义。
[方法] 分别用20、40、60、80、100 μg/ml浓度的LPS作用Chang Liver细胞24 h，采用MTT法检测LPS 对Chang Liver细胞存活率的影响，分别测定Chang Liver细胞上清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γGT）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性，并通过Hoechst 33258荧光染色观察用药24 h后Chang Liver 细胞形态的变化。
[结果] 80和100 μg/ml浓度的LPS作用后Chang Liver细胞存活率显著性降低，胞外AST、ALT、ALP、γGT、LDH酶活性升高，细胞数目减少，细胞形态发生改变，呈现细胞核固缩等细胞凋亡现象。
[结论] 用80 μg/ml的LPS与Chang Liver细胞共培养24 h，可以建立理想的体外肝细胞损伤模型。
关键词LPS； Chang Liver细胞； AST； ALT； Hoechst 33258中图分类号S986.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01071-03基金项目国家自然科学基金面上项目（81273429）；浙江省科技厅重大专项（2013C03036，2011C02003，2011C23034）；舟山市科技计划项目（2012C23023）。
作者简介滕芳芳（1989- ），女，浙江舟山人，硕士研究生，研究方向：海洋功能食品、海洋药物。
*通讯作者，教授，硕士生导师，从事海洋功能食品和海洋药物研究。
脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的成分，其主要是由亲水的多糖和疏水的类脂A组成。
LPS可诱导多种细胞凋亡造成多种细胞损伤，如巨噬细胞RAW264.7、人小肺癌细胞NCLH446、神经细胞PC12、人子宫颈癌传代细胞Hela cell等[14]。
以TNF—α刺激A549细胞构建急性肺损伤细胞模型
以TNF—α刺激A549细胞构建急性肺损伤细胞模型作者：吴炜景张家敏李立平来源：《中国医药科学》2017年第17期[摘要]目的构建急性肺损伤体外细胞模型。
方法以TNF-α 10ng/mL刺激肺泡Ⅱ型上皮A549细胞，采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中IL-4、IL-1 B浓度，比色法检测丙二醛浓度、总超氧化物歧化酶活力，RT-PCR及免疫印迹法分别检测NF-K B mRNA及蛋白的表达水平，流式细胞术检测细胞凋亡率。
结果以TNF-α刺激A549细胞，细胞上清液IL-1β、IL-4浓度上升；细胞内丙二醛增多，超氧化物歧化酶活力下降；NF-кB在基因及蛋白水平表达上调（P[关键词]急性肺损伤；细胞模型；炎症反应；肺泡Ⅱ型上皮细胞；核因子кB；[中图分类号]R563.1；R563.8 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）17-30-03急性肺损伤（acute lung iniury，ALI）是临床常见急危重症，以进行性加重的呼吸困难、顽固的低氧血症为临床特征，其严重阶段可发展为成人呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。
感染、有害物质吸入、外伤、休克、中毒等多种非心源性致病因素是引起急性肺损伤的常见因素，ALI/ARDs缺乏特效治疗，发病率及病死率均处于高水平，因而其发病机制研究仍受科学家重视。
急性肺损伤模型构建是ALI机制研究的基础，在细胞模型上进行研究，再将实验成果在动物模型上进行验证，有利于降低动物实验的成本，提高成功率。
本研究结合急性肺损伤发生时，肺泡Ⅱ型上皮细胞在炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、通路激活等方面的特点，对ALI细胞模型的构建进行探讨。
1材料与方法1.1材料A549细胞由福建医科大学附属第二医院中心实验室提供，RPMI-1640培养基、小牛血清、胰酶来自于Hyclone公司，重组人肿瘤坏死因子-α购自美国的Pepro Tech公司，NF-кB抗体、内参βactin抗体购自美国CST公司，Trizol购买于Invitrogen公司，PCR引物由上海英骏公司合成，RT-PCR及荧光定量PCR试剂购自TaKaRa公司，细胞因子IL-4、IL-1 β ELISA法检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、SOD及MDA检测试剂盒、BCA法蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天公司。
人表皮角质形成细胞急性光损伤模型的构建
态 学 改 变 ，与 空 白 对 照组 相 比 增 殖 活性 降 低 ，凋 亡 率增 加 （ Ｐ＜０ ． Ｏ １ ） ；ｌ １ ． ４～３ ４ ． ２ ｍ Ｊ ／ ｃ ｍ Ｕ Ｖ 射 剂 量增 加 ， 细胞 出现 不 同程 度 损 伤 ， 与 空 白对 照 组 相 比 增 殖 活 性 降 低 ， 凋亡率增加 （ Ｐ＜ ０ ． ０ １ ） 。结论 Ｕ Ｖ Ａ和 Ｕ Ｖ Ｂ 照 射 均 可 构 造 急性 光 损 伤 模 型 。Ｈ ａ Ｃ ａ Ｔ细胞对 Ｕ Ｖ Ｂ敏
５ ５ ６
新 医学 ２ ０ １ ３年 ８月第 ４ ４卷第 ８期
基 础 研 究论 著
人 表皮 角质 形 成 细 胞 急 性 光损 伤模 型 的构 建
邓蕙妍 肖峰 高爱 莉 李润祥 朱 慧 兰 万 苗坚
【 摘要 】 目的 探 讨长 波 紫外 线 （ Ｕ Ｖ Ａ ） 和 中波 紫 外线 （ Ｕ Ｖ Ｂ ） 对人 永 生化 角质形 成 细胞
（ Ｈ ａ Ｃ ａ Ｔ细胞 ）造成急性损伤所 需要 的最 小剂量 ，为构建人 表 皮细胞急性 光损伤模 型提供 科 学依 据 。 方法 用不同剂量的 Ｕ Ｖ Ａ或 Ｕ Ｖ Ｂ照射 Ｈ ａ Ｃ ａ Ｔ细胞 。观察 细胞 形态学改变，检测 细胞 增殖活性 （ 吸光
２ ． ５～１ ０ Ｊ ／ ｃ ｍ Ｕ Ｖ Ａ 照射 对 Ｈ ａ Ｃ ａ Ｔ细 胞 无损 伤 ， ２ ０～ ４ ０ Ｊ ／ ｃ ｍ 可 致 细胞 出现 形 度 ） 和 凋 亡 率 。结 果
感 性 更 高 ，引 起 急 性 光 损 伤 所 需 的 最 小 剂 量 更低 。
【 关键词 】 长波紫外线 ；中波紫外线 ；角质形成细胞 ；光损 伤
Ｃｏｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏｎ ｏｆ ａ ｃ ｕｔ ｅ ｌ ｉ ｇ ｈｔ ｄａ ｍａ ｇ ｅ ｍｏ ｄｅ ｌ ｗｉ ｔ ｈ ｈｕｍ ａｎ ｅ ｐｉ ｄｅ ｒ ｍａ ｌ ｋｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｎ ｏｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ＤＥＮＧ Ｈｕｔ — ｙ ａ ｎ，ＸＩ ＡＯ
帕金森病细胞损伤模型论文
帕金森病细胞损伤模型论文近年来，帕金森病逐渐成为一个备受关注的热点疾病。
帕金森病是一个慢性进行性中枢神经系统疾病，其典型症状包括手臂和腿部震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和不稳定。
帕金森病的发病机制尚不为人所知，但已经有许多研究表明，帕金森病是由脑细胞受损而导致的。
为了更好地了解帕金森病的发病机制，许多研究人员尝试使用细胞损伤来建立帕金森病模型。
在这种模型中，研究人员会给细胞暴露于一些特定的物质，例如多巴胺或氧化应激，以实现细胞的抑制和死亡。
这种模型已经被广泛应用于帕金森病的研究中，并且已经取得了一些有趣的发现。
最近，一组研究人员在《神经科学》杂志上发表了一篇名为“帕金森病细胞损伤的酸性体内质网(AVIN)通路的作用”的论文。
在这篇论文中，研究人员使用了一种新的帕金森病细胞模型，并探究了一种新的细胞损伤机制。
研究结果表明，帕金森病细胞损伤过程中，酸性体内质网(AVIN)通路可能起着重要的作用。
研究人员首先使用多巴胺和氧化应激建立了帕金森病细胞模型，然后通过一系列实验发现，AVIN通路可能与细胞凋亡和氧化应激相关。
此外，研究结果还表明，AVIN通路在帕金森病治疗中可能具有潜在的作用。
这项研究的重要意义在于，它为研究帕金森病的发病机制提供了新的思路和线索。
虽然目前尚无法完全了解AVIN通路的作用机制，但这项研究为未来的研究提供了一些重要的指导意义。
此外，该研究还提出了AVIN通路在帕金森病治疗中的潜在作用，这将为帕金森病的治疗提供新的思路和方向。
总之，帕金森病的细胞损伤模型提供了一种有用的工具，可以帮助我们更好地了解这种疾病的发病机制。
在未来的研究中，我们需要进一步探究AVIN通路的作用机制，以及它在帕金森病治疗中的具体作用，这将为我们更好地治疗和控制帕金森病提供重要的帮助。
10种细胞损伤模型建立方法
10种细胞损伤模型建立方法转载请注明来自丁香园发布日期：2012-10-09 14:36 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：细胞细胞培养技术专题义翘神州丁香园丁香通点击次数：997现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。
一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx 活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
10种细胞损伤模型建立方法
10种细胞损伤模型建立方法转载请注明来自丁香园发布日期：2012-10-09 14:36 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：细胞细胞培养技术专题义翘神州丁香园丁香通点击次数：997现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。
一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的M DA含量和G SHpx 活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
胰岛细胞损伤体外模型的建立及在药物筛选中的应用
胰岛细胞损伤体外模型的建立及在药物筛选中的应用孙海峰;常虹;郭雪莹;刘丽佳【摘要】Objective:To establish a Pancreatic Islet cells model in vitro for screening drugs from traditional Chinese medicine with the function of promoting and restoring Pancreatic Islet cells by this model. Method; INS - 1 cells inoculated into 96 - well plate, then injured by alloxan, the viability of INS -1 cells in different concentrations of alloxan was evaluated by the method of MIT. Study the effect on promoting Pancreatic Islet of different medicine in this model. Result: INS-1 cells with a cell density of 1 x 104 cell o well-1 inoculated into 96 - well plate, and injured by 12 mmol o L-1 alloxan after cell attachment 24h. Then the damage model of Langerhans island cell was created; some Chinese traditional medicines could protect and restore INS-1 cells injured by alloxan, such as Potentilla Discolor Bunge (PDB), Ginkgo biloba leaves (EGb). Conclusion: Astable induced Pancreatic Islet cell model can be established by this method and drugs with the effect of protecting and restoring Pancreatic Islet cells are screened.%目的:体外建立胰岛细胞损伤模型,并初步应用于保护和修复胰岛细胞中药的筛选.方法:将INS-1胰岛细胞接种于96孔板中,以四氧嘧啶诱导建立体外胰岛细胞损伤模型,MTT法测定不同剂量四氧嘧啶对细胞活力的影响,并应用于研究不同药物对损伤的胰岛细胞的增殖作用.结果:将密度为1×104个/孔的INS -1细胞接种于96孔板,细胞24h贴壁后予以12mmol·L-1四氧嘧啶诱导,可建立稳定的胰岛细胞损伤模型；翻白草、银杏叶能够保护和修复四氧嘧啶损伤的INS -1细胞.结论:以四氧嘧啶诱导胰岛细胞损伤的方法,可建立稳定的体外胰岛细胞损伤模型,并可用于保护修复胰岛细胞药物的筛选.【期刊名称】《中医药学报》【年(卷),期】2012(040)003【总页数】4页(P53-56)【关键词】INS-1;四氧嘧啶;中药筛选【作者】孙海峰;常虹;郭雪莹;刘丽佳【作者单位】黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040【正文语种】中文【中图分类】R285.5糖尿病(DM)是继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染病，严重威胁人类健康［1］。
内皮细胞低氧复氧损伤模型的建立
[收稿日期]㊀2021-03-12[修回日期]㊀2021-04-16[基金项目]㊀湖南省教育厅科学研究重点项目(19A432)[作者简介]㊀胡佳,硕士,研究方向为心血管病病因㊁发病机制及防治,E-mail 为879471434@㊂通信作者韦星,博士,副教授,硕士研究生导师,研究方向为心血管病病因㊁发病机制及防治,E-mail 为weijiajun17528@㊂㊃实验研究㊃[文章编号]㊀1007-3949(2021)29-06-0506-06内皮细胞低氧复氧损伤模型的建立胡佳,谢佳欣,成姣,韦星(南华大学心血管疾病研究所动脉硬化学湖南省重点实验室湖南省动脉硬化性疾病国际科技创新合作基地,湖南省衡阳市421001)[关键词]㊀人脐静脉内皮细胞;㊀低氧复氧损伤模型;㊀三气培养箱[摘㊀要]㊀目的㊀构建人血管内皮细胞低氧复氧损伤模型,作为心肌组织慢复流的体外研究模型㊂方法㊀设定三气培养箱的混合气中5%O 2为低氧培养条件,二氧化碳培养箱(95%空气㊁5%CO 2)中的培养条件为复氧条件㊂将对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC )随机分为5组,分别置于三气培养箱(90%N 2㊁5%CO 2㊁5%O 2)中处理不同时间(0㊁4㊁8㊁16及32h )㊂挑选出最佳低氧处理时间后,再将随机分组的细胞进行不同时间(0㊁1㊁2㊁3㊁4㊁5及6h )的复氧处理㊂Western blot 检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)的蛋白表达;显微镜下观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞存活率;酶联免疫吸附法测定乳酸脱氢酶(LDH )活性以反映细胞损伤情况㊂结果㊀与对照组相比,实验组HUVEC 的HIF-1α蛋白表达随低氧处理时间的延长而增高(P <0.01);细胞密度在低氧处理的短时间内会适应性增加,从16h 开始降低;细胞存活率的变化趋势与细胞密度一致(P <0.01);LDH 活性则在低氧4h 时升高,低氧8h 时回落,低氧16h 时又重新回升(P <0.01)㊂复氧后,细胞密度与细胞存活率的变化随时间呈现先降低后升高的趋势(P <0.05);LDH 活性则随时间呈现先升高后降低的趋势,峰值出现于复氧3h (P <0.01)㊂实验结果表明,低氧16h 为最佳低氧处理时间,复氧3h 为最佳复氧处理时间㊂结论㊀本研究建立了稳定可靠的HUVEC 低氧复氧损伤模型,为心肌组织缺血再灌注后慢复流的体外实验研究奠定了基础㊂[中图分类号]㊀R331;R54[文献标识码]㊀AEstablishment of hypoxia /reoxygenation injury model of endothelial cellsHU Jia,XIE Jiaxin,CHENG Jiao,WEI Xing(Institute of Cardiovascular Diseases &Key Laboratory for Arteriosclerology of Hunan Province &Hunan International Scien-tific and Technological Cooperation Base of Arteriosclerotic Disease ,University of South China ,Hengyang ,Hunan 421001,China )[KEY WORDS ]㊀human umbilical vein endothelial cell;㊀hypoxia /reoxygenation injury model;㊀three-gas incubator[ABSTRACT ]㊀㊀Aim ㊀To establish a hypoxia /reoxygenation injury model of human vascular endothelial cells as an in vitro study model of myocardial slow-reflow.㊀㊀Methods ㊀5%O 2in the mixture of three-gas incubator was set as hypoxia culture condition,and the culture condition in carbon dioxide incubator (95%air and 5%CO 2)was set as reoxygenationcondition.㊀Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)in logarithmic growth stage was randomly divided into five groups,and treated in three-gas incubator (90%N 2,5%CO 2and 5%O 2)for different time (0,4,8,16and 32h).㊀After selecting the best hypoxia treatment time,the cells randomly divided into groups were reoxygenated for different time (0,1,2,3,4,5and 6h).㊀Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)protein expression was detected by Western blot;Cell morphological changes were observed under microscope;CCK-8method was used to detect the cell survival rate;Lactate dehydrogenase (LDH)activity was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)to reflect cell damage.Results ㊀Compared with the control group,the expression of HIF-1αprotein of HUVEC in the experimental group in-creased with the prolongation of hypoxia treatment time (P <0.01).㊀Cell density increased adaptively in a short time after hypoxia treatment and decreased from 16h;The change trend of cell survival rate was consistent with cell density (P <0.01).㊀LDH activity increased at 4h of hypoxia,decreased at 8h of hypoxia,and increased again at 16h of hypoxia(P<0.01).㊀After reoxygenation,the changes of cell density and cell survival rate showed a trend of first decreasing and then increasing with time(P<0.05).㊀LDH activity showed a trend of first increasing and then decreasing with time,and the peak value appeared at3h after reoxygenation(P<0.01).㊀The experimental results showed that16h of hypoxia was the best hypoxia treatment time,and3h of reoxygenation was the best reoxygenation treatment time.㊀㊀Conclusion㊀In this study,a stable and reliable HUVEC hypoxia/reoxygenation injury model is established,which lay the foundation for the in vitro experimental study of slow-reflow after myocardial tissue ischemia/reperfusion.㊀㊀临床上有约10%~50%的急性心肌梗死患者在行血运重建治疗后会出现慢复流(slow-reflow)或无复流现象,即存在冠状动脉血流无法正常恢复的情况,增加了在院死亡率及再发心肌梗死的发生率[1-2]㊂其发生机制与血管内皮细胞的结构和功能损伤有关,由于细胞钙超载㊁自由基生成增多㊁局部舒缩血管因子不平衡等的发生,加之内皮细胞释放的黏附分子增多㊁微血管壁通透性增加,可使心肌组织的血液灌流出现障碍[3]㊂因此,如何在心肌血运重建时尽可能地维持内皮细胞功能,减轻其损伤,继而减少慢复流或无复流的发生,成为临床研究的一个热点㊂慢复流发生时,因心肌组织仍有血液供应,与完全断流的无复流现象有所不同,因而慢复流的发生机制是否与无复流有所区别尚待研究㊂因此,建立稳定的内皮细胞低氧复氧(hypoxia/ reoxygenation)损伤模型,对于研究慢复流的发生机制具有重要意义㊂细胞低氧复氧损伤模型不同于完全缺氧,是在细胞低氧供的基础上再恢复正常供氧,从而制造细胞损伤模型㊂国内外现有的文献报道细胞缺氧模型的建立方法分物理性方法与化学性方法㊂物理性方法主要包括液体石蜡封闭法㊁缺氧密闭盒混合气体法及混合气体培养法;化学性方法包括氯化钴法㊁连二亚硫酸钠(Na2S2O4)法和叠氮法等[4-11]㊂为了模拟更接近体内的慢复流损伤,本研究采用三气培养箱制作细胞低氧模型,对不同的低氧处理时间和复氧时间下的细胞状态进行动态观察,借此构建稳定有效的内皮细胞低氧复氧损伤模型㊂1㊀材料和方法1.1㊀主要材料、试剂与仪器原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)购自中国科学院细胞库;细胞培养基(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);胰酶细胞消化液(Gibco公司);磷酸盐缓冲液(PBS) (北京索莱宝科技有限公司);细胞计数检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)(江苏碧云天生物技术公司);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)试剂盒(南京建成公司);低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)抗体(Proteintech公司);三气培养箱(Esco公司);倒置光学相差显微镜(Olympus公司)㊂1.2㊀内皮细胞低氧复氧损伤模型的构建(1)细胞培养:将HUVEC接种于含10%胎牛血清的培养瓶中,放入二氧化碳培养箱中培养,每1 ~2天更换新鲜培养液,当细胞长至约80%融合度时进行消化传代或分组㊂(2)低氧处理时间的确定:细胞被随机分为5组,即对照组(低氧0h,H0h组)与不同低氧处理时间的4个实验组:H4h组㊁H8h组㊁H16h组和H32h 组,实验组分别接受4㊁8㊁16及32h的低氧处理㊂低氧处理时,HUVEC换用无糖无血清培养基,并置入含90%N2㊁5%CO2㊁5%O2混合气的三气培养箱中培养㊂对照组正常培养㊁换液,无低氧㊁复氧处理㊂处理结束后通过观察细胞形态及检测相应指标来确定最佳低氧处理时间㊂(3)复氧时间的确定:细胞被随机分为7组,即对照组(复氧0h,R0h组)与不同复氧时间的6个实验组:R1h组㊁R2h组㊁R3h组㊁R4h组㊁R5h组和R6h组,实验组分别接受1㊁2㊁3㊁4㊁5及6h的复氧处理㊂以二氧化碳培养箱(95%空气㊁5%CO2)中的培养条件为复氧条件㊂实验组细胞在行最佳低氧处理时间处理完成之后换用正常完全培养基,并置入二氧化碳培养箱中实施常规培养㊂处理结束后通过观察细胞形态及检测相应指标来确定最佳复氧时间㊂(4)细胞形态学观察:各组细胞处理完成后,在倒置光学相差显微镜下观察细胞形态及贴壁细胞数量变化㊂1.3㊀Western blot检测HIF-1α的表达去掉培养瓶中培养液,用预冷的PBS洗两次并沥干,在细胞贴壁面加入裂解液和苯甲基磺酰氟(体积比为94ʒ6),然后在冰上静置40min㊂待充分裂解后,刮下细胞,并吸入离心管中,将离心管置于已经预冷的离心机中,4ħ,12000r /min 离心10min ㊂离心后留取上清液加入1ʒ4比例的缓冲液充分混匀,煮沸10min 后置于冰上冷却,10min 后放入-20ħ冰箱保存㊂制胶后上样,经过电泳㊁转膜㊁封闭和抗体孵育后,配制显影液进行显影㊂1.4㊀CCK-8法检测细胞存活率各组细胞处理完成后,在避光条件下加入CCK-8溶液10μL /孔(96孔板),于培养箱中孵育1h ㊂用酶标仪测定在450nm 处的吸光度值㊂1.5㊀LDH 活性检测收集各组细胞上清液,按照LDH ELISA 试剂盒要求进行操作,用酶标仪测定在450nm 处的吸光度值㊂1.6㊀统计学分析所有指标均重复测量3次,取均值㊂采用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行统计学分析,数据以x ʃs 表示,利用单因素方差分析比较组间差异,P <0.05为差异具有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀最佳低氧时间的确定2.1.1㊀不同低氧时间低氧有效性验证 HIF-1α蛋白的表达㊀㊀相较于H0h 组,H8h 组㊁H16h 组㊁H32h 组细胞的HIF-1α蛋白表达显著增高㊂同时,H8h 组㊁H16h 组㊁H32h 组也存在组间差异,随着低氧时间的延长,HUVEC 中HIF-1α蛋白的表达逐渐增高(图1)㊂图1.不同低氧时间处理HUVEC 后HIF-1α蛋白表达的变化(n =3)a 为P <0.01,与H0h 组比较㊂Figure 1.Changes of HIF-1αprotein expression after HUVEC treated with different hypoxic time (n =3)2.1.2㊀不同低氧时间细胞形态学改变㊀㊀在倒置显微镜镜下通过形态学观察,H0h 组细胞贴壁生长,生长良好,细胞呈短梭形,密度高㊂而随着低氧时间的延长,细胞逐渐减少,漂浮细胞逐渐增多,细胞呈长梭形,贴壁细胞密度下降,细胞之间间隙增大,培养液愈见浑浊,折光度渐差㊂特别是H16h 组㊁H32h 组,细胞密度以及细胞形态出现明显改变(图2)㊂图2.不同低氧时间处理后HUVEC 形态学改变A 为H0h 组;B 为H4h 组;C 为H8h 组;D 为H16h 组;E 为H32h 组㊂Figure 2.Morphological changes of HUVEC after treatment with different hypoxic time2.1.3㊀不同低氧时间细胞存活率㊀㊀CCK-8结果显示,相较于H0h 组,H8h 组细胞存活率明显增高;而与H8h 组进行对比,H16h 组和H32h 组细胞存活率显著降低㊂提示在低氧时间较短时,细胞继续增殖,而随着低氧时间的继续延长,细胞存活率显著下降(图3)㊂图3.不同低氧时间处理后HUVEC 存活率变化(n =3)a 为P <0.01,与H0h 组比较;b 为P <0.01,与H8h 组比较㊂Figure 3.Changes of HUVEC survival rate after treatment with different hypoxic time (n =3)2.1.4㊀不同低氧时间LDH 活性变化㊀㊀ELISA 检测细胞上清液中LDH 活性,结果显示,相较于H0h 组,H8h 组上清液中LDH 活性降低;而与H8h 组比较,H16h 组㊁H32h 组上清液中LDH 活性明显升高㊂提示随着低氧时间的延长,所造成的细胞损伤进一步加重(图4)㊂㊀㊀根据上述实验结果,选择低氧16h 作为最佳低氧处理时间㊂图4.不同低氧时间处理后HUVEC 上清液LDH 活性变化(n =3)a 为P <0.01,与H0h 组比较;b 为P <0.01,与H8h 组比较㊂Figure 4.Changes of LDH activity in HUVEC supernatant after treatment with differenthypoxic time (n =3)2.2㊀最佳复氧时间的确定2.2.1㊀不同复氧时间细胞形态学改变㊀㊀倒置显微镜镜下显示,R1h 组㊁R2h 组㊁R3h 组的细胞密度逐渐降低,漂浮细胞逐渐增多㊂而随着复氧时间的进一步加长,R4h 组㊁R5h 组㊁R6h 组的细胞密度又会逐渐增高,细胞形态趋于正常㊂提示R3h 组细胞的低氧复氧性损伤较大(图5)㊂图5.不同复氧时间处理后HUVEC 形态学改变A 为R0h 组;B 为R1h 组;C 为R2h 组;D 为R3h 组;E 为R4h 组;F 为R5h 组;G 为R6h 组㊂Figure 5.Morphological changes of HUVEC after treatment with different reoxygenation time2.2.2㊀不同复氧时间细胞存活率㊀㊀CCK-8实验结果显示,R2h 组㊁R3h 组㊁R4h 组细胞存活率均低于R0h 组,特别是R3h 组细胞存活率显著降低,但随着复氧时间进一步延长,细胞存活率逐渐升高(图6)㊂图6.不同复氧时间处理后HUVEC 存活率变化(n =3)a 为P <0.05,b 为P <0.01,与R0h 组比较㊂Figure 6.Changes of HUVEC survival rate after treatment with different reoxygenation time (n =3)2.2.3㊀不同复氧时间LDH 活性变化㊀㊀通过采用ELISA 检测细胞上清液中LDH 活性,结果显示,R2h 组㊁R3h 组㊁R4h 组㊁R5h 组LDH 活性均较R0h 组上升,尤其是R3h 组LDH 活性升高最明显㊂提示低氧后复氧可使细胞上清液中LDH 活性逐渐增高,而随着时间的进一步延长,由于细胞趋于正常而使升高的LDH 活性逐渐回落(图7)㊂根据上述实验结果,选择复氧3h 作为最佳复氧时间㊂图7.不同复氧时间处理后HUVEC 上清液LDH 活性变化(n =3)a 为P <0.01,与R0h 组比较㊂Figure 7.Changes of LDH activity in HUVEC supernatant after treatment with differentreoxygenation time (n =3)3㊀讨㊀论组织缺血后实施复灌的过程中,慢复流或无复流是否出现及其程度可以影响缺血再灌注之后的预后㊂慢复流或无复流的发生与血管内皮细胞,尤其是微血管内皮细胞在缺血再灌注时的功能变化相关,因此,采用内皮细胞建立可靠的低氧复氧损伤模型是从细胞水平探讨慢复流发生机制所必需的实验手段㊂本实验在建模的过程中发现,在体微血管内皮细胞不仅获取效率低下,难以培养,而且鉴定过程较为复杂,所需经济成本较高㊂而HUVEC 与之有相似的生理特性,在获取㊁培养及经济成本方面有着不可比拟的优势,因此本研究选择采用HUVEC 进行模型的构建㊂目前用于缺氧的所有方法中,化学性方法采用氯化钴或Na 2S 2O 4等作为氧清除剂,但其具有毒性,且化学性质不稳定;物理性方法中的液体石蜡封闭法,尽管易于获取,操作也较为简单,但存在镜下易受油滴干扰而影响视野的弊端;厌氧袋法虽无毒无害且密闭性好,但无法保证长时间的缺氧效果;安宁包法虽价格低廉,但无法确定氧气浓度保证缺氧效果㊂而三气培养箱采取N 2㊁CO 2㊁O 2三种气体以不同比例混合供给,可以精确地调控并监测氧气浓度,稳定性强,操作简便,可重复性高,因而可提供一个可靠的低氧环境㊂本实验采用含5%O 2的混合气来制备低氧复氧损伤模型,相较于常规的采用含1%~2%O 2的混合气制备低氧复氧损伤模型,更能模拟在体的慢复流损伤,旨在为慢复流机制的研究提供方便快捷㊁高效稳定的细胞模型㊂HUVEC 出现损伤时其细胞的形态㊁功能㊁生理生化指标以及细胞的存活率将受到直接影响㊂水溶性四唑盐(WST-8)可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜,而CCK-8是基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速且高灵敏度检测的方法㊂HIF-1只有在低氧条件下才可稳定表达,其α亚基是调节细胞对低氧反应的主要转录因子,对缺血后血管形成㊁细胞代谢㊁细胞存活等方面起到重要作用㊂LDH 是机体能量代谢中的一种重要酶,是细胞代谢和能量传递的重要物质,细胞培养液中LDH 的活性可以反映出细胞的损伤程度㊂本实验采取倒置显微镜观察细胞形态的同时采用以上3种方法对细胞的损伤程度进行检测,以期获得最适低氧复氧损伤模型㊂本实验结果显示,HIF-1α的蛋白表达随HUVEC 低氧时间的延长而逐渐升高,细胞存活率也在出现低氧适应性增长之后逐渐降低,并且该结果与镜下形态学观察一致:在低氧处理进行的短时间里,细胞不仅未出现明显损伤,反而出现适应性增殖;而低氧16h后,细胞的形态出现较大改变,贴壁细胞减少,漂浮死细胞增多㊂这说明细胞可通过自身调节来适应低氧性环境㊂实验结果还显示:LDH 活性在低氧8h出现了明显下降,说明细胞正处于增殖高峰而未出现明显损伤,其结果与CCK-8的结果相一致;而在低氧16h甚至更长时间之后,LDH 活性逐渐增高,表明其损伤开始出现并愈为严重㊂因此,本实验选择低氧16h作为最佳低氧处理时间㊂通过观察细胞不同复氧时间的动态变化,发现在经历16h低氧损伤后,复氧的细胞存活率先随时间逐渐降低,并在复氧3h达到最低值,具体表现为细胞存活率明显降低及上清液中LDH明显升高;之后随着复氧时间的延长,细胞存活率开始回升及上清液中LDH回降㊂说明复氧3h细胞受到低氧复氧的损伤最明显㊂牛其芳等[12]制备的内皮细胞缺氧复氧模型发现,随着复氧时间的延长,细胞损伤会加重㊂本实验结果与其结果不同,说明低氧复氧对内皮细胞的损伤轻于缺氧复氧对内皮细胞的损伤,其机制可能与供氧浓度的高低有关㊂综上所述,本方法通过对低氧及复氧时间两个因素进行把控,分别设置了低氧及复氧的时间梯度,从而得到了具说服力的低氧复氧损伤模型,可以稳定且较好地模拟低氧复氧损伤过程㊂就整个操作过程和效果而言,利用三气培养箱构建内皮细胞的低氧复氧损伤模型,具有方便㊁可重复性高㊁易于观察等优点,能在慢复流的发生机制以及干预研究中提供有利帮助㊂[参考文献][1]ZHANG Y,WANG Y,XU J,et al.Melatonin attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury via improving mito-chondrial fusion/mitophagy and activating the AMPK-OPA1 signaling pathways[J].J Pineal Res,2019,66(2):e12542.[2]ZHOU H,MA Q,ZHU P,et al.Protective role of melatonin in cardiac ischemia-reperfusion injury:from pathogenesis to targeted therapy[J].J Pineal Res,2018.DOI:10.1111/ jpi.12471.[3]谭凤梅,韦星,颜姝,等.内皮细胞损伤与心肌无复流现象[J].中国动脉硬化杂志,2013,21(1):89-92.[4]项和立,薛武军,侯军,等.重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2006,22(4):472-474. [5]YANG L,WU J,XIE P,et al.Sevoflurane postconditioning alleviates hypoxia-reoxygenation injury of cardiomyocytes by promoting mitochondrial autophagy through the HIF-1/ BNIP3signaling pathway[J].PeerJ,2019,7:e7165.[6]刘飞,付微,乔陆明,等.快速建立心肌细胞低氧/复氧损伤模型的方法[J].牡丹江医学院学报,2017,38 (2):1-5.[7]张春燕,肖斌,邵军,等.人参皂甙对缺氧复氧致肾小管上皮细胞损伤保护作用的蛋白质组学分析[J].西南医科大学学报,2019,42(3):207-210. [8]李梦妮,董文斌,曹敏,等.复方丹参注射液减轻低氧/复氧性HK-2细胞损伤的作用及机制[J].中国当代儿科杂志,2007,9(6):559-562.[9]WANG J K,BAI T,MA H,et al.Propofol attenuates human proximal renal tubular epithelial cell injury induced by anoxia-reoxygenation[J].Lab Med,2008,39(6):356-360.[10]杜玉颖,孟思妤,常莉,等.两种不同方法建立H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤模型比较[J].临床军医杂志, 2019,47(4):357-359.[11]GUAN F,YU B,QI G X,et al.Chemical hypoxia-induced glucose transporter-4translocation in neonatal rat cardiomyocytes[J].Arch Med Res,2008,39(1):52-60.[12]牛其芳,李德龙,杨杨,等.人血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型的建立[J].中国口腔颌面外科杂志, 2019,17(4):295-299.(此文编辑㊀曾学清)。
软骨细胞损伤模型建立的方法
- 损伤的程度和区域应ห้องสมุดไป่ตู้可控，以便进行后续的实验和观察。
- 应该注意避免对周围组织和器官造成不必要的损伤，保证实验的安全性。
- 需要合适的对照组，比较损伤模型和正常组织的差异。
- 在建立模型的过程中需要严格遵守实验伦理和规范，确保动物和细胞的福利和权益受到保护。
请注意，在进行实验前，应详细了解和遵守相关的伦理委员会和法律法规的要求，确保实验的合法性和道德性。
3. 冷冻损伤模型：将软骨组织暴露在低温条件下，然后迅速解冻，这样可以引起软骨细胞的机械破坏和细胞凋亡。这种方法常用于小鼠或大鼠软骨损伤模型的构建。
4. 热损伤模型：通过热能的作用引起软骨组织的损伤。常用的方法包括激光照射、高频射频、微波等。这些热能可以直接破坏软骨细胞，并导致细胞凋亡和炎症反应。
5. 细胞培养损伤模型：将软骨细胞培养在体外，在培养皿中用机械、化学、热能等方法对细胞进行损伤。这种模型可以控制损伤的程度和时间，更方便研究细胞损伤和修复的机制。
软骨细胞损伤模型建立的方法
建立软骨细胞损伤模型的方法多种多样，下面列举一些常用的方法：
1. 机械创伤模型：通过机械手段对软骨进行直接创伤，如利用针尖、刮刀、剪刀等工具对软骨进行切割、撕裂或压迫，模拟软骨损伤的过程。这种方法可以控制造成的损伤程度和区域。
2. 化学损伤模型：通过化学物质引起软骨细胞损伤。常用的化学损伤剂包括酸、碱、酶等。这些化学物质可以直接作用于软骨组织，破坏细胞结构和功能。
电刺激C2C12_细胞构建运动损伤修复模型
运动人体科学2023年(第13卷)第34期电刺激C2C12细胞构建运动损伤修复模型郑娅雯1袁梦1刘秀娟2*张欣2(1.南京体育学院研究生部;2.南京体育学院运动健康学院江苏南京210014)摘要：电脉冲刺激（EPS）是研究收缩诱导运动性适应的主要工具，为探究电脉冲刺激对C2C12细胞蛋白表达和代谢的影响，并观察刺激后的指标恢复变化，试图建立骨骼肌C2C12细胞运动损伤修复模型。
将C2C12细胞培养和分化为肌管后，根据电压强度不同分为4组：C组（对照组）、V1组（10V）、V2组（23V）、V4（40V），在相同频率20 ms、1 Hz条件下电刺激40 min，尝试诱发C2C12肌管细胞的收缩与损伤，按恢复时间点收集0h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h后的细胞培养液和细胞，分别检测肌酸激酶（CK）活力、乳酸脱氢酶（LDH）活性和丝裂原活化蛋白（P38）含量变化。
结果显示，40 V组C2C12细胞经过电刺激后，P38含量极显著增加，CK活力极显著增加，LDH活性极显著增加，并随着恢复时间延长而逐步减少。
故在40 V、40 min、20 ms、1 Hz的方案下，电刺激C2C12细胞可以构建骨骼肌运动损伤模型，且这种损伤在此后4~8 h内得以恢复。
关键词：电刺激 C2C12细胞 运动损伤修复 建模中图分类号： G804文献标识码：A文章编号： 2095-2813(2023)34-0001-03电脉冲刺激（Electrical Pulse Stimulation，EPS）应用于细胞系和培养的原代骨骼肌细胞的骨骼肌肌管已被证明是研究收缩诱导运动性适应的主要工具［1］，其中C2C12细胞是体外研究骨骼肌内部机制的常用细胞模型［2］，可以表达各种成熟骨骼肌中存在的标志蛋白，因此为体外研究成肌细胞增殖和分化的首选模型［3］。
用电脉冲刺激模拟神经元刺激激活体外培养的骨骼肌细胞，从而促进骨骼肌细胞收缩达到模拟运动的效果。
MIN6细胞损伤模型不同造模方法对比研究
MIN6细胞损伤模型不同造模方法对比研究程瑞婷;王晨斌;田春雨;高秀娟;吴晨曦;朱亮;李继安;郑彩莲;喇孝瑾【摘要】①目的通过比较MIN6细胞损伤模型的不同建立方法,筛选最佳造模方法.②方法将生长状态良好的MIN6细胞分入96孔板,培养至对数生长期后分别以不同浓度棕榈酸(PA)、葡萄糖(GLU)、棕榈酸+葡萄糖(PA+GLU)、地塞米松(DXM)和过氧化氢(H2O2)干预12小时, CCK-8试剂盒检测细胞活力,计算IC50.设立对照组,以IC50浓度分别干预6小时后流式细胞仪检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞胰岛素分泌.③结果细胞活力结果显示各造模剂均有良好的剂量依赖性;分别以IC50浓度干预后,细胞早期凋亡和晚期凋亡均比对照组有所增加,其中PA+GLU早期凋亡、胰岛素分泌量较高.④结论 PA+GLU干预MIN6细胞后早期凋亡比例增加和刺激胰岛素分泌增加比较接近体内情况,符合造模需求.【期刊名称】《河北联合大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(019)004【总页数】5页(P258-262)【关键词】2型糖尿病;MIN6细胞损伤模型;胰岛素【作者】程瑞婷;王晨斌;田春雨;高秀娟;吴晨曦;朱亮;李继安;郑彩莲;喇孝瑾【作者单位】华北理工大学中医学院河北唐山 063000;华北理工大学中医学院河北唐山 063000;华北理工大学中医学院河北唐山 063000;华北理工大学中医学院河北唐山 063000;华北理工大学中医学院河北唐山 063000;华北理工大学中医学院河北唐山 063000;华北理工大学中医学院河北唐山 063000;唐山市曹妃甸区医院重症医学科;华北理工大学中医学院河北唐山 063000【正文语种】中文【中图分类】R329在以往的研究中，胰岛素抵抗被认为是2型糖尿病(T2DM)发生、发展的主要因素[1]。
随着对T2DM机制研究的日渐深入，胰岛β细胞自身数量减少和功能受损在T2DM中的作用越来越受到重视，二者直接导致胰岛素分泌量的绝对减少、血糖升高，不断升高的血糖又反过来进一步损害β细胞功能，增加β细胞凋亡，从而形成恶性循环[2,3]。
平滑肌细胞过氧化氢损伤模型
平滑肌细胞过氧化氢损伤模型平滑肌细胞是一种重要的细胞类型，存在于人体中的多个器官中，如血管、消化道和呼吸道等。
它的功能是调节器官的张力和平滑肌收缩，从而实现正常的生理功能。
然而，过氧化氢（H2O2）的积累会对平滑肌细胞造成损伤，进而影响器官的正常功能。
过氧化氢是一种强氧化剂，在细胞内产生的过程中会产生活性氧自由基，进而导致氧化应激反应。
长期以来，人们一直认为过氧化氢主要通过氧化脂质和蛋白质，引发细胞损伤和细胞死亡。
然而，最近的研究表明，过氧化氢对平滑肌细胞的损伤机制更为复杂。
研究发现，过氧化氢可以通过多种途径影响平滑肌细胞的功能。
首先，过氧化氢可以直接氧化和破坏平滑肌细胞的膜脂质，导致细胞的膜完整性受损。
其次，过氧化氢可以通过激活信号转导通路，如磷酸化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB），影响细胞的增殖和凋亡。
此外，过氧化氢还可以影响细胞内的钙离子平衡，进而影响平滑肌细胞的收缩和舒张。
研究人员通过建立平滑肌细胞过氧化氢损伤模型，揭示了过氧化氢对平滑肌细胞的损伤机制。
他们发现，过氧化氢可以诱导平滑肌细胞产生大量的活性氧自由基，进而引发氧化应激反应。
这些自由基可以氧化和破坏细胞膜，导致细胞的膜完整性受损。
同时，过氧化氢还可以激活MAPK和NF-κB等信号转导通路，进而引发细胞的凋亡和炎症反应。
为了更好地理解平滑肌细胞对过氧化氢的损伤反应，研究人员还探索了一些可能的保护策略。
他们发现，抗氧化剂可以有效地减轻过氧化氢引起的平滑肌细胞损伤。
抗氧化剂可以清除细胞内的活性氧自由基，减轻氧化应激反应。
此外，一些研究还发现，一些天然产物和药物可以通过调节MAPK和NF-κB等信号转导通路，减轻过氧化氢对平滑肌细胞的损伤。
平滑肌细胞过氧化氢损伤模型的建立为我们深入了解过氧化氢对平滑肌细胞的损伤机制提供了重要的研究工具。
通过揭示这些机制，我们可以更好地理解平滑肌细胞在疾病发生和发展中的作用，并为开发新的治疗策略提供理论依据。
LPS致肝细胞损伤模型的建立研究
LPS致肝细胞损伤模型的建立研究滕芳芳;胡晓斐;刘晨晨;杨最素;黄芳芳;丁国芳【摘要】[目的]探索LPS体外致人Chang Liver细胞损伤模型的建立方法和意义.[方法]分别用20、40、60、80、100 μg/ml浓度的LPS作用Chang Liver细胞24h,采用MTT法检测LPS对Chang Liver细胞存活率的影响,分别测定Chang Liver细胞上清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性,并通过Hoechst 33258荧光染色观察用药24h后Chang Liver细胞形态的变化.[结果]80和100μg/ml浓度的LPS作用后Chang Liver细胞存活率显著性降低,胞外AST、ALT、ALP、γ-GT、LDH酶活性升高,细胞数目减少,细胞形态发生改变,呈现细胞核固缩等细胞凋亡现象.[结论]用80μg/ml的LPS与Chang Liver细胞共培养24h,可以建立理想的体外肝细胞损伤模型.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(042)004【总页数】3页(P1071-1073)【关键词】LPS;Chang Liver细胞;AST;ALT;Hoechst 3325【作者】滕芳芳;胡晓斐;刘晨晨;杨最素;黄芳芳;丁国芳【作者单位】浙江海洋学院食品与医药学院,浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心,浙江舟山316022;浙江省舟山医院,浙江舟山316021;浙江海洋学院食品与医药学院,浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心,浙江舟山316022;浙江海洋学院食品与医药学院,浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心,浙江舟山316022;浙江海洋学院食品与医药学院,浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心,浙江舟山316022;浙江海洋学院食品与医药学院,浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心,浙江舟山316022【正文语种】中文【中图分类】S986.2脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的成分，其主要是由亲水的多糖和疏水的类脂A组成。
过氧化氢诱导PC12细胞损伤的模型的建立
过氧化氢诱导PC12细胞损伤的模型的建立李朝晖;王芬;刘水平;刘艳艳;竞花兰【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2007(023)003【摘要】目的建立不同浓度的H2O2诱导PC12细胞凋亡的模型,研究组织缺血、自由基损伤的机制.方法分别以不同浓度的H2O2处理PC12细胞12h.用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术检测处理后细胞的生长活力和凋亡情况.结果以0浓度组作为对照,100、300nmol/L的H2O2处理的PCI2细胞生存率分别为(76±7.69)%、(39±7.08)%(P《0.01);0、100、300nmol/L的H2O2处理的PCI2细胞后凋亡率分别为2.47%、6.00%和55.54%.结论建立了以0、100、300nmol/L的H2O2诱导PCI2细胞凋亡的模型.【总页数】3页(P191-192,195)【作者】李朝晖;王芬;刘水平;刘艳艳;竞花兰【作者单位】中山大学中山医学院法医学系,广东,广州,510089;中山大学中山医学院法医学系,广东,广州,510089;中山大学中山医学院法医学系,广东,广州,510089;中山大学中山医学院法医学系,广东,广州,510089;中山大学中山医学院法医学系,广东,广州,510089【正文语种】中文【中图分类】DF795.1【相关文献】1.槲皮苷对过氧化氢诱导PC12细胞损伤的保护作用 [J], 江芮;吕浩;李申;王丽莉2.延龄草苷对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤和炎症因子表达的影响 [J], 高健美;徐凡;雷鸣;刘双;龚其海3.硫酸粘菌素诱导PC12细胞损伤模型的建立 [J], 刘洋;李继昌4.长白山核桃源五肽对过氧化氢诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用及机理 [J], 郭勇;秦汉雄;魏贞;方丽;闵伟红5.姜黄素对过氧化氢诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用 [J], Li Jinwen;Xu Yueying;Cao Tiansou;Liang Qifeng;Li Li因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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一、体外肝细胞损伤模型建立(CCｌ4与H2O2)ﻫ 1 大鼠肝细胞得分离与培养大鼠4％戊巴比妥麻醉,门静脉插管,先以无钙灌流液灌流,继以3７℃通入Ｏ２得Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内,轻轻撕去肝包膜后,加入含5％小牛血清得清洗液,用吸管吹打成单个肝细胞悬液,２00目尼龙网过滤,低速离心(５0０r·miｎ-1,1 mｉｎ,4℃)弃上清,同法用清洗液反复洗3次、然后用完全1640培养液(内含10％小牛血清,10５U·L－1青霉素,1０0 mg·L—1链霉素与10 mg·L-1胰岛素)制成１×109个·L-１肝细胞悬液、分离得肝细胞经0、6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于９0％,高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定9９％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入２４孔(每孔１mｌ)与96孔(每孔０。
１ml)培养板中,置３７℃,5%CO2培养箱中培养。
１2～１6 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长、ﻫ2 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立肝细胞培养12 h后,吸弃上清,更换培养液并加入不同浓度得ＣＣl4〔(1～1６mｍｏｌ·Ｌ-1),以少量得二甲亚砜助溶,二甲亚砜终浓度为0、1％(体积分数)〕,作用不同时间(1～12h)后,收集２4孔板中培养上清检测AST,以及肝细胞得MDA含量与ＧSHpｘ活性;同步测定96孔板中培养肝细胞得MTT反应。
根据检测结果制备CＣｌ4诱导肝细胞损伤得量效与时效曲线、选择最造损伤浓度与损伤时间制备肝细胞得损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设３个复孔、３H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立同法更换培养液,加入不同浓度得H２O2(０.２～３。
2 ｍmol·Ｌ—１),作用不同时间(0、5～4 h)后,收集24孔板中培养上清检测AＬT,测定肝细胞得MDA含量;同步测定９６孔板中培养肝细胞得MTT反应。
根据检测结果制备H2Ｏ2诱导肝细胞损伤得量效与时效曲线,选择最适损伤浓度与损伤时间制备肝细胞得损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设3个复孔。
ﻫ4检测指标ﻫ(1) AST、ALT得测定培养得肝细胞经离心(1 800ｒ·ｍiｎ-1,1０mｉｎ)后收集上清,按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST与(或)ALT活性,结果以U·(１06cell)-1表示、(2) 肝细胞增殖试验采用MTＴ比色法、ﻫﻫ(３) 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSHｐx)活性得测定先制备GSH标准曲线。
弃肝细胞培养上清,加入0、２％Tritｏn－100水溶液0。
5 ｍｌ,混匀,２min后,离心(2500 ｒ·mｉn-１,1０ｍin),取上清液(肝细胞样品)0.4 ml,另设样品空白管,非酶反应管与试剂空白管,加入各种试剂。
混匀后立即计时,静置１2 min后,以样品空白管调零点,于42３nm波长处读得吸光度(A)值。
在GSH标准曲线上查出对应得ＧＳH波度。
GＳHpx酶活力单位就是在3７℃,pH6、５条件下,每106个肝细胞、每分钟使GSＨ浓度下降１μｍｏｌ为１个酶活力单位。
计算公式为:GSHpx 活力单位=(［GＳH］非酶管－［GSＨ]样品管－［ＧSH］试剂空白管)/3。
结果以Ｕ·(10６ｃｅlｌ)-1表示。
ﻫ(4 ) 肝细胞丙二醛(MＤA)含量得测定先制备MＤA标准曲线。
弃肝细胞培养上清,加入生理盐水1 ｍl,混匀,移入离心管中,离心(2 500 r·min－1,10 miｎ),弃上清,加15％TCA ２mｌ,破坏细胞并沉淀蛋白质,加入0.６7%TＢA ２ml,于沸水浴中加热3０mｉn。
根据样本得吸光度值在标准曲线上查出对应得浓度,结果以nmol·(１06 ｃelｌ)—1表示。
ﻫ(5) 数据处理数据以±s表示,计量资料组间比较采用t检验。
两变量间相互关系,采用直线相关与回归分析。
ﻫ二、体内肝损伤模型(酒精)ﻫ１、材料纯系SD雄性大鼠,体重180g～２00 g,由浙江大学医学院实验动物中心提供。
食用酒精选用北京酿酒总厂出品得56度红星二锅头。
ﻫ2、方法将大鼠随机分成5组,饲养在23℃~２５℃室内,自由进食、进水;根据大鼠体重,A、B、Ｃ、D组每日用56°红星二锅头白酒以1０mｌ/1Kｇ分别灌胃0、４周、8周与12周;E组于酒精灌胃１2周后,停止灌胃4周。
大鼠通过股动脉采血处死,收集血浆与肝脏标本、3ﻫﻫ、主要指标检测ﻫﻫ(１)肝功能:应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白(ＴP)、白蛋白(Alｂ)、球蛋白(Ｇlb)、丙氨酸氨基转移酶(AＬＴ)与天冬氨酸氨基转移酶(AS Ｔ)等。
ﻫ(2)氧化抗氧化物质测定:采用南京建成生物工程研究所提供得试剂盒分别检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSＨ-Ｐx)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SＯＤ)与谷胱甘肽－S－转移酶(GST)。
ﻫ(3)大鼠肝脏病理检查:大鼠处死后立即取出肝脏,称重后一部分以１0％得福尔马林液固定作病理,作常规石蜡切块并HＥ染色,在光学显微镜下进行观察,用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型ﻫ原代培养得正常大鼠肝细胞培养2４ｈ(贴壁良好)后,置培养皿于一密闭得塑料盒,内置四氯化碳0、４Ｍ容积,37度90ｍiｎ,造成肝细胞损伤得模型,后转入正常培养,进行下一步实验。
(即熏蒸法)ﻫ肝细胞培养1２h后,吸弃上清,更换培养液并加入CＣL4 8mM(事先用DMSO溶解,DMSO 终浓度1%),作用６h后收集24孔板中培养上清检测ASＴ以及肝细胞MＤA含量盒GSＨｐx活性,评价损伤程度。
(常用方法)ﻫﻫ四、醋氨酚体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后,用清洗液洗2次,培养液洗1次,然后换以２0mM醋氨酚得培养液,继续培养1２h,取培养液,进行下一步实验。
ﻫ五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型ﻫ肝细胞培养２4h后,吸弃上清液,更换培养液并加入H２O2０.６mM,作用１h后,收集２4孔板中得培养上清液检测ＡST活性与MDA含量、六、氰化钾缺氧肝细胞损伤模型肝细胞培养24h后,贴壁生长良好得肝细胞中加入氰化钾2.5mM,继续培养2ｈ,定量检测培养液上清中LDH活性,以及酶得活性反应肝细胞损伤程度、本模型可以更好得模拟缺氧损伤。
ﻫ七、硫代乙酰胺(TTA)体外肝细胞损伤模型ﻫ肝细胞预培养24h后,贴壁生长良好得肝细胞中加入TTA0.18mＭ,继续培养48h,肝细胞大量损伤与坏死,上清液中乳酸脱氢酶(LDＨ)活性升高,造成体外损伤肝细胞模型。
ﻫﻫ八、内毒素体外损伤肝细胞模型ﻫ贴壁生长良好得肝细胞中加入内毒素70uL/mＬ,置３７度,5％CＯ2培养此时上清ＬＤH活性升高造成肝细胞损伤模型,造成体外肝细胞损伤模型、ﻫ九、半乳糖胺(GａｌN)体外损伤模型分离肝细胞,预培养12—24ｈ后,待细胞贴壁生长均匀后,加入5mＭGalN得肝细胞培养液,继续培养1.5h,测定培养上清液中ALＴ,ALT显著升高时,肝细胞造模成功。
ﻫﻫ十、帕金森体外模型体外培养得中脑多巴胺能神经元MＰTP损伤模型ﻫﻫl实验操作:实验采用胚胎龄14一16天得大鼠,剖子宫取胎,取胎鼠中脑腹侧区。
可将多个胚胎来源得组织收集在一起,置Fｌ2培养基(Ｇｉｂco)至３5ｍm得培养皿中,以细剪刀剪碎。
将2ml含0、１２5％得胰酶得F1２加入到组织中,该混合物于３7℃孵育1０分钟后,加入DNase I(Siｇma)至终浓度80ｎg／m１,继续于3７oC孵育1０分钟、消化后得组织以尖端被火抛光得移液管轻轻吹打8次。
该细胞悬液以种植培养基稀释(种植培养基:MEM,补充以2ｍm谷氨酰胺,6mg/mｌ葡萄糖,1mｇ/ｍl谷胱甘肽,１0 ｕｎｉtｓ/mｌ青霉素,10ul/ml链霉素与7.5％胎牛血清)。
细胞然后种植于3５mm得预先以10ug／m１ｐo１y1yｓｉne (Sigmａ)与2。
5ug／mｌmerｏｓin(Chｅmiｃｏn)铺底得培养皿中,种植密度为５0,0０0细胞／cm ２。
培养16小时后,培养基换为无血清培养基。
该培养基为F1２与baｓa1Eａg1e's m ｅdｉum,补充以33mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺, １5 mＭ碳酸氢钠,１0ｍM ＨEPEＳ(pH7.0),1ｕg/ml谷胱甘肽,20uｇ/ｍl胰岛素,100ｕg/ml转铁蛋白,６０ｕＭ腐胺,20nM孕酮,20nM亚硒酸钠(NaSe),3０nM三碘甲状腺原氨酸,0、5unit/ml青霉素与0、5mｇ/ｍl链霉素、ﻫ毒物处理:于第4天以1uMMP+处理48小时、然后进行分析。
ﻫ模型评价:倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TＨ阳性细胞得数目与形态。
ﻫ体外培养得中脑多巴胺能神经元６—OHDA损伤模型ﻫ采用上述方法选择胎鼠,分离中脑腹侧部,解剖显微镜下仔细剔除脑膜与血管,用高糖T—ＢSS反复冲洗涤之七遍。
并将组织剪碎,移入0。
25%胰蛋白酶溶液中,37ｏC振荡消化3０分钟,后加入血清数滴终止消化,用吸管轻轻吹打后,加入不含血清得DMEＭ培养液混匀,1０00rpｍ,10ｍin离心收集细胞,反复2次,后加入含血清得完全DＭＥＭ培养液悬浮细胞,过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液,计数后将约３×１０6个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸得35mm得六孔培养板中,置３7oC、5％CＯ2培养箱中培养。
2４小时后待细胞完全贴壁时,置换旧培养液,以后每隔2天更换一次培养液。
培养至第六天时加入100uM得6-ＯHDA处理3小时后吸出、在相应备孔中加入完全DＭEM培养液洗涤２遍,再加入完全DMEM培养液继续置5％CＯ2培养箱中培养24小时,采用与上述相同得方法做免疫细胞化学染色,计数TＨ阳性细胞,确立6—ＯＨＤA对体外培养得多已胺能神经元得损伤作用。
ﻫ十一、Ａβ损伤模型取出生１-２d得乳鼠,用麻醉剂处死。
在D－hanks液中取大脑并分离海马组织,胰蛋白酶消化,获得细胞悬液,胎盘蓝染色进行死活细胞记数,将细胞以５×1０５/ｍl得密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理得9６孔与２4孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。
细胞维持在培养液中,置入5％ＣＯ２,饱与湿度得培养箱中培养,24h后全换液,接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次,培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmoｌ／L,以抑制神经胶质细胞得过度增殖,２4h后更换全部培养液继续培养,第1０天进行细胞造模,开始实验。
ﻫ也可以用PC１２细胞株,常规培养ﻫﻫＡβ产物诱导海马神经细胞,建立细胞模型:ﻫ选择Ａβ25-3５片段,用三蒸水配制成１0０μmol?？Ｌ－1,过滤,分装,-2０℃冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。