植物愈伤组织的继代培养

愈伤组织的诱导和培养

班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。

通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。

二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。

植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。

三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。

洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。

进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。

3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。

取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。

4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。

组织培养第三章愈伤组织培养资料

2、操作程序
获取外植体材料－消毒处理－修整除去坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5 －6块外植体－培养。选用较大组织做材料时，可用打孔器从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：
能得到外形简单结构相同的材料
第一节愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。
一、愈伤组织的诱导（一）诱导原理 1、细胞全能性植物每一细胞具有全套遗传信息，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完整的个体。
（二）在园艺植物育种中的应用： 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度，迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子
植物离体培养中的器官发生类型：不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。多数植物培养采用。
圆形的表面积大
圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
培养基
MS培养基激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。
二、愈伤组织细胞的分化
单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致经历三个时期，这三个时期中细胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。
细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期— —球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子叶期

橡胶树花药愈伤组织继代培养与胚状体发生能力研究

⑨ 带让技２３热农科０４１（１１），
一一１
橡胶树花药愈伤组织继代培养与胚状体发生能力研究
梁国平，凤翔，黄管艳，李玲，肖三元
（南省热带作物科学研究所，南景洪６６０）云云６１０
ＡｎｈｒＣａｌｌｕｅａｄＳｍａｉｔｅｌｕｓＣｕｔｒｎｏｔｃＥｍｂｙｇｎｓｓＡｂｌｔｅｎＨｅｅｒｓｌｅｓｓｒｏｅｅｉｉｉｉｓｉＰａｂａｉｉｎｉ
ＬＩＡＮＧＧｕｏ－ｐｉ，ＨＵＡＮＧｎｇＦｅｎｇ－ｘａｎｉｇ，ＧＵＡＮｎ，ＬＩＬｉ，ＸＩＹａｎｇＡＯＳｈａｎ—ｙｕａｎ
他继代次数之间差异不显著。在继代８后，种培养基的诱导率逐渐升高，别达到４．％和代两分４６
３３％。５．
关键词：胶树；药培养；伤组织；代培养；状体橡花愈继胚
中图分类号：７４１５文献标识码：文章编号：６２４０２１）１００ — ３５９．０Ａ１７ — ５ ×（０１０ — ０１０
摘要：用橡胶树花药愈伤组织进行继代培养与胚状体诱导，果表明，利结在诱导愈伤组织、继代培养
和分化胚状体中ＭＳ养基稍优于改良ＭＳ养基；继代１的愈伤组织胚状体的诱导率最高，培培以代分别达到７．０８％和６．：继代０、７５％在代２代和３代之间差异达到极显著，继代４时差异达到显著，在代其

实验愈伤组织的继代与分化培养

实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。

二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。

通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。

将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。

三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。

四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。

1）超净工作台等准备工作：同前。

2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。

如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。

3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。

4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。

五、观察记载内容与实验报告1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。

每隔3天观察一次。

2、实验报告1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析A. 描述培养物的变化及其形态特征；B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。

再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。

说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。

愈伤组织的继代培养

实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。

【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。

打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。

打开风机吹风15分钟，
备用。

2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。

3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。

【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。

思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。

继代培养增殖类型及特点

继代培养增殖类型及特点研究了这么久继代培养增殖类型及特点，总算发现了一些门道。

首先呢，继代培养增殖有好几种类型。

有一种是侧芽增殖，就像是树会长侧枝一样。

植物的茎尖或者侧芽呀，在适宜的培养条件下，就像被唤醒了生长的潜力，不停地萌发出新的侧芽来。

举个例子，就像我们家里养的那种富贵竹，你要是给它一定的营养条件和环境，它会不断地从茎的旁边冒出新的小芽。

这种侧芽增殖的特点就是它能够比较好地保持植物母株的优良性状。

因为这些侧芽就像是母株的小分身，它们继承了母株的绝大多数特性。

还有一种叫不定芽增殖。

这个有点神奇了呢，它不是从原有的芽上面长出来的，而是从植物的一些其他的组织，像根、叶这些部位长出来新的芽。

这就好比你本来觉得苹果只能从苹果树枝条上长花芽结果，但突然发现苹果根旁边也能莫名其妙地长出小芽来。

这种增殖类型的特点就是繁殖速度可能会比较快。

因为理论上植物身上好多地方都有可能长出不定芽，不再局限于几个特定的部位。

不过呢，有时候它可能不太稳定，可能受到培养条件影响比较大。

另外还有通过愈伤组织增殖的类型。

这感觉就像是把植物组织弄伤了，但这个伤口却能变成新生命的发源地。

这个愈伤组织就像一个多能的小工厂，既能分化出新的芽，又能长出新的根。

但我一直搞不太明白的是，这个过程中怎么去精准控制它的分化方向呢？有时候感觉是个碰运气的事儿。

比如说，我们在培养某种花卉的时候，当形成愈伤组织后，我们想要它多长芽，可它有时候却更多地长出根来。

这就很让人头疼。

这些呀，就是我对继代培养增殖类型及它们特点的一些观察和发现啦。

还有一个关于继代培养增殖的点，这些不同的增殖类型的条件要求都不太一样。

侧芽增殖呢，可能对激素浓度要求比较微妙，就好比做蛋糕的时候，糖放多放少都会影响口感。

激素浓度多一分少一分都可能影响侧芽萌发的数量和速度。

不定芽增殖可能在光照或者温度上某些植物会比较特别。

比如说，有的植物在温度稍微低一点的时候就更容易形成不定芽，可有的就不是。

名词解释

一、名词解释愈伤组织(callus):原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。

在组织培养中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

继代培养：对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养玻璃化苗：指试管苗因生理失调而引起的嫩茎、叶片出现半透明状和水渍状的现象。

其苗称为玻璃化苗。

花粉胚：用花粉经过人工的组织培养而形成的幼胚，发育成的植株就只有正常胚一半的染色体组，所以由花粉胚发育成的植株不会产生种子。

生理隔离：植物传粉后或动物交配后，由于生理上的不协调而不能完成受精作用的现象。

种植保存：指利用天然或人工创造的适宜环境保存种植资源，使个体中所包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。

脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下恢复细胞分裂能力,失去原有分化状态的过程叫做脱分化。

全能性：是指干细胞具有的分化成机体所有类型细胞和形成完全胚胎的能力。

人工种子：指通过组织培养技术，将植物的体细胞诱导在形态上和生理上均与合子胚相似的体细胞胚，然后将它包埋于有一定营养成分和保护功能的介质中，组成便于播种的类似种子的单位。

炼苗：是在保护地育苗的情况下，采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼的过程，使其定植后能够迅速适应陆地的不良环境条件，缩短缓苗时间，增强对低温、大风等的抵抗能力。

再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出胚状体，形成完整植株，这一过程叫作再分化。

褐变：指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。

脱毒培养：利用组织培养技术，脱除植物细胞中的病毒，生产健康的无毒繁殖材料的过程。

胚状体：亦称体细胞胚。

指在组培过程中，由植物体细胞所形成的类似于合子胚的结构。

细胞培养：是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境，在无菌，适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

第三章-愈伤组织诱导

第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。

愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。

一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。

细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。

持续十几小时~几天。

2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。

3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。

若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。

2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。

颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。

一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。

3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。

迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。

其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。

生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。

二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。

愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。

第六章植物愈伤组织培养

诱导期的长短和诱导分裂的难易程度，因植物种类、外植体的生理状况和外部因素而异。外源生长调节物质对诱导细胞开始分裂效果最好，最常用的有2,4-D、NAA、IAA和细胞分裂素等。
•Байду номын сангаас
•
2、分裂期
分裂期 (division stage) 是不断增生子细胞的过程。其特征是:细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。主要表现如下:
三、植物愈伤组织的形成过程
从单细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历4个时期:
诱导期分裂期形成期分化期
1、诱导期 (起动期)
•
诱导期 (induction stage)是细胞准备进行分裂的时期,通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使处在静止状态的细胞合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成。此期间细胞的大小变化不大。
① 细胞的数目迅速增加。 ② 每个细胞平均鲜重下降。
③ 细胞体积小，细胞内无液泡
④ 细胞核和核仁增至最大
⑤ 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
⑥ 组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。
3、形成期
形成期 (formation stage)是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了无序结构的愈伤组织的时期。这一时期愈伤组织内细胞有以下特点是: ① 大而不规则、高度液泡化，整个组织是比较松散的。 ② 表面以下约5～10个细胞是细胞生长的中心这些中心是愈伤组织的主要生长部位。
四、植物愈伤组织的继代培养
一般在愈伤组织长到直径2～3cm时才将其与外植体分离，单独培养，并将其切成4-8个小块继续培养，此即继代培养。用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保存愈伤组织的一种方法。继代培养可选取生长迅速的部位。从外表看，生长迅速的愈伤组织多呈浅色、质地松散。若要进行愈伤组织的分化和再生，则应选生长较慢的愈伤组织。每二次继代培养的时间取决于愈伤组织的生长速度。一般可在4-6周继代一次。

实验2-4胡萝卜愈伤组织的继代培养

及时继代
愈伤组织在培养过程中会逐渐老化，为保证实验的准确性，应及时进行继代培养。
03
实验结果与分析
实验结果
实验观察记录
在继代培养过程中，胡萝卜愈伤组织表现出良好的生长状态，细胞分裂活跃，质地松软，颜色鲜艳。
显微镜观察
通过显微镜观察，发现细胞分裂旺盛，细胞排列紧密，呈现出典型的愈伤组织结构。
在未来的实验中，我们可以尝试优化培养条件，如温度、光照、湿度等，以提高愈伤组织的生长速度和质量。
此外，我们还可以进一步研究愈伤组织在继代培养过程中的基因表达和分子机制，为植物组织培养和基因工程领域的发展做出贡献。
我们可以通过添加植物激素或其他生长因子来调节愈伤组织的生长和分化，以实现更好的实验效果。
2. 制备培养基
按照MS培养基配方，添加适量的植物生长调节剂和糖，搅拌均匀后倒入培养容器中，待培养基凝固。
3. 接种外植体
将准备好的外植体放置在培养基上，确保外植体与培养基接触良好。
4. 培养条件
将培养容器放置在恒温、恒湿、无菌的环境中，保持适宜的温度和光照条件。
5. 继代培养
经过一段时间的培养后，观察愈伤组织的生长情况，当愈伤组织长满培养基时，将其切割成小块，重新接种到新的培养基上，进行继代培养。
薄壁细胞团。
通过将愈伤组织进行继代培养，可以保持其生长和分化能力，并对其进行遗传转化、次生代谢产
物生产等方面的研究。
实验采用的培养基通常含有植物生长调节剂、无机盐、维生素等成分，以促进愈伤组织的生长和
分化。
实验背景
植物细胞培养技术是近年来发展迅速的生物技术领域之一，在农业生产、生物医药、工业生产等方面具有广泛的应用前景。

胡萝卜愈伤组织培养及继代培养(实验报告)

本科学生综合性实验报告
学号：094120275 姓名：陈小华
学院：生命科学学院专业、班级：09应用生物教育B班实验课程名称：胡萝卜的愈伤组织诱导培养及继代培养
教师：杨世忠
开课学期：2011 至2012 学年第二学期填报时间：2012 年 5 月18 日
云南师范大学教务处编印
）无菌操作流程：
二．实验报告
图1胡萝卜愈伤组织诱导培养结果
2号瓶内的胡萝卜愈伤组织长势良好，1、3和4号瓶内胡萝卜均被
图2 胡萝卜愈伤组织继代培养结果
具体说明如表2：
表2 胡萝卜愈伤组织继代结果统计
2 存活瓶数 2
1号瓶内愈伤组织为Ⅱ型愈伤组织，其结构松脆，生长旺盛，
鲜艳，增值很快，称为亢进分裂型。

2号瓶内愈伤组织为Ⅰ型愈伤
组织，其结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型。

第五章继代培养

A 选择适当的基因型和适当的外植体。 B 选择正确的培养基，特别是正确的植物激
素的种类和浓度，以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配比。
第五章继代培养
C 采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。在玉米幼胚愈伤组织培养中，一些研究者通
过在培养基中添加5mg/L或10mg/L AgNO3，抑制愈伤组织内乙烯的作用，从而使类型II愈伤组织的频率显著提高。
第五章继代培养
六、继代培养
1、愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程收继代。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。
2、通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保存持在不分化的增殖状态。
第五章继代培养
如果让愈伤组织留在原来的培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化。
第五章继代培养
第二阶段为分裂期（细胞从开始分裂到持续分裂的时期）：细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、 RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡,RNA含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。
第五章继代培养
持自然生长方向接种；有时为了促进侧枝的形成，茎尖接种时也可以水平放置在培养基上；
第五章继代培养
3、要定期对培养物进行观察和统计，根据培养物生长情况及时对培养基和培养条件做出调整；
4、培养过程中经常会出现污染现象，要及时加以清除；
5、在继代培养时一定要仔细检查，避免将污染的材料进行扩大增殖。
第五章继代培养
五、愈伤组织分为3种主要类型：

第03章-愈伤组织愈伤、继代及培养

5
2、外植体材料的准备与消毒：外植体的消毒一般采用次氯酸钠（市面上销售的一般为10-14%有效氯），使用时按1:10稀释，消毒时间以材料定，消毒后无菌水冲洗4-5次；或用 0.1%汞消毒。如果没有特殊的条件要求，在无菌条件下发芽种子能产生无菌的根、茎、叶（无菌苗），较适于诱导愈伤组织。种子是诱导愈伤组织的很好起始材料，因为：（1）可将整粒种子放在加有生长物质的培养基上使其直接产生愈伤组织；（2）在无激素的培养基上发芽，可产生无菌的根、茎、叶用于外植体；（3）可直接从种子上剪下根原基及芽尖用作外植体。
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（二）、影响器官发生的因素

化学因素：从早期烟草组织的研究我们知道，器官发生的表达受外源化学物质控制，高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖-无组织的生长。相反，高浓度的分裂素能引起茎-芽（shoot-bud）形成。同时，ausion/cytokinin之比值的变化成为特定的器官、根或芽分化的一个参数，一个基本规律是：生长素促进根分化，分裂素促进芽分化。生长素与根形成有关，同时对愈伤组织的保持也是必须的。在促进芽的分化中，BAP是最有效的。
固体培养
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悬浮培养的用途：

提供一个相对一致的细胞群体（供生化研究、胚胎发生研究、胚的同步化研究等）。能快速吸收外源物质，检查药效。研究次生代谢、酶诱导、基因表达、抗生素的降解的良好实验体系。多数悬浮细胞缺乏叶绿体、色素，对酶和次生物质的分离及纯化十分有利。细胞增值速度快，适于大规模培养。分离原生质体的良好细胞来源。

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器官发生型的应用
• • 细胞、原生质体培养；无芽组织的分化；
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五叶地锦茎段愈伤组织的诱导和继代培养

文章编号五叶地锦茎段愈伤组织的诱导和继代培养徐萌!李青北京林业大学园林学院北京摘要以五叶地锦带芽茎段为外植体在附加的培养基上诱导得到结构良好的愈伤组织附加和的培养基是愈伤组织继代培养的最佳培养基继代周期为可有效降低愈伤组织继代过程中的褐化现象关键词五叶地锦愈伤组织继代培养中图分类号文献标识码五叶地锦是葡萄科地锦属落叶藤本植物五叶地锦攀缘能力强是园林垂直绿化的优良材料本种秋季叶色红艳是园林中不可多得的秋色叶树种五叶地锦愈伤组织可以做为单倍体筛选悬浮细胞系建立原生质体游离的材料是细胞突变诱导与筛选原生质体培养与融合基因转化等诸多生物技术应用的前提本试验利用五叶地锦带芽茎段诱导出愈伤组织该愈伤组织在继代培养基上可长期保持良好的结构材料和方法材料选用五叶地锦带芽茎段为外植体五叶地锦茎段愈伤组织的诱导采集五叶地锦新发幼茎取带芽茎段切成左右用消毒液预处理在自来水下流水冲洗在超净工作台上用镊子挑取经过预处理的带芽茎段放入无菌三角瓶中用酒精消毒再用升汞溶液浸泡～用无菌水冲洗～遍然后用镊子取带芽茎段接种于培养基上在～光照下诱导和继代培养愈伤组织培养温度为～以为基本培养基诱导愈伤组织的培养基①②③④以上培养基均附加蔗糖琼脂五叶地锦茎段愈伤组织的继代培养继代时愈伤组织的选择经光照培养后可看到多种类型的愈伤组织出现选择其中结构紧密浅绿色边缘块状表面颗粒状突起的愈伤组织转到继代培养基上继代培养基本培养基的选择莱阳农学院学报～收稿日期基金项目北京林业大学研究生培养基金资助项目编号作者简介徐萌女山东莱阳人北京林业大学园林学院在读硕士主要研究方向为园林植物组织培养通讯作者李青以和培养基作为愈伤组织继代培养的基本培养基选择最适合愈伤组织继代培养的基本培养基植物生长调节物质对胚性愈伤组织继代培养的影响比较不同植物生长调节剂种类使用浓度及组合对愈伤组织继代培养的影响继代培养周期对胚性愈伤组织继代培养的影响比较不同继代培养周期对愈伤组织继代培养的影响结果和分析植物生长调节物质的种类!使用浓度及组合对五叶地锦茎段愈伤组织诱导的影响光培养周后五叶地锦的茎段切口处开始膨大部分切口先后长出愈伤组织培养的结果表表明与组合诱导愈伤组织的诱导率高于与组合的诱导率在浓度相同时浓度为时愈伤组织的诱导率高于浓度为时的诱导率但是两个处理得到的愈伤组织都是白色松散结构缺少叶绿体并且呈现水浸状这种愈伤组织无法分化成苗在浓度相同时浓度较低时愈伤组织结构紧密中央呈浅绿色小颗粒状边缘为块状愈伤组织在其后的继代培养中易保持良好的结构当浓度升高至时虽然愈伤组织的诱导率达到但愈伤组织结构松散呈白色水浸状所以从保持愈伤组织良好的结构和提高植株再生率方面考虑以附加与的培养基诱导的愈伤组织较为理想表不同植物生长调节物质浓度对五叶地锦茎段愈伤组织诱导的影响植物生长调节物质浓度接种茎段数形成愈伤组织块数诱导率愈伤组织类型结构较松散白色水浸状结构较松散白色水浸状结构紧密浅绿色块状中央颗粒状结构松散白色水浸状注培养后测定的结果五叶地锦愈伤组织的继代增殖培养和基本培养基对愈伤组织继代增殖的影响从培养基附加与中获得的愈伤组织在原培养基中继代培养时愈伤组织边缘为块状结构中央为少量翠绿色小颗粒状突起结构紧密在中继代培养时愈伤组织表面呈小颗粒状突起浅绿色和白色颜色较鲜艳结构较松散但是在以后的继代培养中在中培养的愈伤组织易于褐化死亡而在中培养的愈伤组织一直保持良好的结构生长旺盛因此选择培养基做为五叶地锦茎段愈伤组织继代培养的基本培养基植物生长调节物质的种类!浓度和组合对愈伤组织继代增殖的影响从培养基附加与中得到的愈伤组织继代培养在附加的培养基中观察比较不同植物生长调节物质对愈伤组织继代培养的影响培养～后观察的结果表明培养基中附加不同浓度的与当浓度为时愈伤组织结构紧密块状中央有小颗粒状突起浅绿色当浓度为时愈伤组织生长较快结构较疏松且长出根状物随着继代培养时间的延长根状物生长为根当浓度为时愈伤组织在接种初期生长较快但以后逐渐褐化培养基中附加不同浓度的与当浓度为时愈伤组织结构较紧密浅黄绿色块状中央有少量小颗粒状突起当浓度为时愈伤组织结构松散白色水渍状当浓度为时愈伤组织严重褐化试验结果表明浓度高于时不利于愈伤组织保持良好的结构愈伤组织的褐化程度随培养时间而加重当浓度较低时愈伤组织结构较紧密块状表面有少量小颗粒状突起而且随着继代期徐萌等五叶地锦茎段愈伤组织的诱导和继代培养培养时间延长结的构紧密的块状愈伤组织会转化成疏松的小颗粒状愈伤组织颜色由浅绿色变为黄绿色据报道这种愈伤组织镜检为球形细胞质较浓的胚性愈伤组织有较强的分生能力对植株再生有重要的意义继代培养时间长短对克服愈伤组织褐化的影响愈伤组织在中长期继代培养愈伤组织容易褐化本文研究了在同一继代培养基上不同的继代培养时间对于克服褐化的作用选择边缘褐化的愈伤组织分别于继代次后观察愈伤组织生长情况观察结果如表表不同植物生长调节物质浓度对五叶地锦茎段愈伤组织继代增殖的影响植物生长调节物质浓度愈伤组织类型结构紧密浅绿色表面小颗粒状突起结构较疏松浅绿色或白色块状有根状物褐化结构较紧密浅黄绿色块状结构松散白色水渍状褐化注继代培养～后观察的结果表不同继代时间对于克服愈伤组织褐化的影响继代时间愈伤组织生长情况生长较慢依然有褐化现象生长快没有褐化现象表面小颗粒状黄绿色几乎不生长褐化严重死亡注培养后观察的结果试验结果表明不同继代天数对愈伤组织生长情况有明显影响每继代次愈伤组织生长较慢仍然有褐化现象每继代次愈伤组织生长快没有褐化现象表面小颗粒状浅绿色每继代次愈伤组织几乎不生长褐化严重死亡说明继代时间过短愈伤组织没有时间恢复生长生长慢而且褐化现象仍存在继代时间过长酚类物质氧化形成的醌类物质扩散到培养基中抑制其他酶的活性毒害愈伤组织只有当继代时间为时愈伤组织没有褐化现象表面为疏松的小颗粒状黄绿色因此继代时间为有利于克服愈伤组织褐化讨论愈伤组织的诱导在五叶地锦茎段愈伤组织的诱导过程中存在着包括基因型外植体生理状况培养基培养条件植物生长调节物质等多方面的影响因素～其中植物生长调节物质是非常重要的影响因素实验发现与组合及与组合都能够诱导出愈伤组织但是与组合诱导得到的愈伤组织都呈白色松散结构缺少叶绿体并且呈现水浸状这种愈伤组织无法分化成苗只有较低浓度的与组合诱导得到的愈伤组织结构紧密中央呈浅绿色小颗粒状边缘为块状愈伤组织在其后的继代培养中易保持良好的结构愈伤组织的继代培养继代培养时应选择结构紧密浅绿色边缘块状表面颗粒状突起的愈伤组织进行继代培养选择作为愈伤组织继代培养的基本培养基附加与的培养基是愈伤组织继代培养的最佳培养基试验中没有观察到愈伤组织再分化不定芽或者产生胚状体说明五叶地锦通过愈伤组织途径再生植株较困难需要从外植体种类生理状况再生途径激素配比等方面再做进一步研究褐化现象的克服褐化是由于组织中的多酚氧化酶过氧化物酶等被激活使组织中的酚类物质氧化成醌类物质而使组织呈棕褐色并抑制其他酶的活性毒害培养物严重影响细胞的生长和分化成为组织培养中的一大障碍提高继代培养时细胞分裂素的浓度有刺激多酚氧化酶过氧化物酶活性提高的作用浓度高于时不利于愈伤组织保持良好的结构愈伤组织的褐化程度随培养时间而加重胚性愈伤组织的胚胎发生能力随培养时间的延长而逐渐减弱对轻度褐化的愈伤组织转入含有低浓度的培养基中可有效降低褐化程度当浓度较低时愈伤组织能够保持良好的结构此外将愈伤组织连续转移到新鲜培养基上在一定程度上可以缓解褐化如兰花核桃瑞香紫叶黄栌等茎尖或腋芽培养中使用了这个!下接页"莱阳农学院学报卷附源程序及输出结果源程序!＠＠!!!!!输出结果""!上接页"方法不同继代时间对克服愈伤组织褐化现象有明显影响继代时间过短或过长均不利于克服褐化现象继代时间适中可有效克服褐化现象参考文献"中国植物志编委会主编中国植物志第卷第分册北京科学出版社范志强杜希华蹇兆忠等葡萄花药胚性愈伤组织的诱导与保持山东师大学报李正红孙振元地锦的组织培养及植株再生植物生理学通讯陈洪国熊月明不同外植体和生长调节剂对猕猴桃愈伤组织形成和再分化的影响福建果树孟新法张利无核葡萄胚发育及早期离体培养的研究H培养方式对离体胚发育的影响北京农业大学学报周俊辉周家容曾浩森等园艺植物组织培养中的褐化现象及抗褐化研究进展园艺学报增刊鲍雪珍张克忠沈利爽等葡萄胚性愈伤组织无性系的建立保持及其植株再生的研究山东大学学报谭文澄戴策刚主编观赏植物组织培养技术北京中国林业出版社袁巧平董茂山黄钦才核桃的组织培养植物生理学通讯张林淡红瑞香的组织培养和快速繁殖植物生理学通讯张永红紫叶黄栌的离体快速繁殖植物生理学通讯期张双灵等软件在盐酸副玫瑰苯胺法中的应用简报。

胡萝卜愈伤组织的诱导与继代培养实验报告

本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级
实验小组及成员
实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
二．实验报告
1．实验现象与结果
A实验结果记录表：
愈伤组织诱导结果：
总接种瓶数5瓶总接种块数15块
污染瓶数4瓶污染块数11块
未污染瓶数1瓶未污染块数4块
未污染块中愈伤组织发生块数3块
愈伤组织发生率75%
愈伤组织发生情况记录愈伤组织的色泽较新鲜，但比较少
污染情况及原因分析污染瓶中，有1 瓶是霉菌污染，3瓶细菌污染。

可能是接种过程中接种器械消毒不够，掀开封口
膜时碰到了封口膜里面，也可能是封口膜没绑好。

愈伤组织继代培养结果：
继代培养没有受到污染，愈伤组织增殖情况较好，呈现不规则状。

颜色浅黄，注意看会有一些小黑点，愈伤组织开始老化，部分开始分化。

B实验结果图片。

植物愈伤组织培养

酶活力增加
细胞的大小变化不大
第一节植物愈伤组织及形成过程
二植物愈伤组织的形成过程：
诱导期长短
植物种类
外植体生理状况
外部因素
第一节植物愈伤组织及形成过程
二植物愈伤组织的形成过程：
分裂期：细胞通过一分为二的分裂，不断
增生子细胞
细胞分裂快
结构疏松
缺少有组织的结构
颜色浅而透明
第一节植物愈伤组织及形成过程
第6章植物愈伤组织培养
•2024/8/27
愈伤组织：原是指植物受伤之后于伤口表面形成的一团薄
壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体的增生细胞产生的一团不定形、疏松的薄壁细胞。
第一节植物愈伤组织及形成过程
增殖培养基
连续有丝分裂
分化组织中不分裂的静止细
胞
细胞进入分裂状态，变为分
养
体获取
的芽
的种子
花序
长的幼
胚
光培诱白不紧保分软软下养导色透密持离而而
或皿暗易处于
到明的浅的黄
和
胚胶透性质明
培组状的
培观养察
色的
养
织的，，，有
继常时
代带生
培根根
养
愈伤组织培养的应用
1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度； 2、培育无病毒苗木； 3、获得倍性不同的植株； 4、克服远缘杂交困难； 5、利于种质资源长期保存和远距离运输； 6、提供育种中间材料； 7、诱发和离体筛选突变体； 8、制造人工种子。
第一节植物愈伤组织及形成过程
二植物愈伤组织的形成过程：
诱导期（起动期）