小鼠肝枯否细胞的分离、培养与鉴定
肝星状细胞分离培养及鉴定的试验方案
肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案【试验原理】在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于一高度提纯的区带中而得以分离。
【试验动物】雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。
【试剂与仪器】主要试剂Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】1、肝星状细胞的分离制备1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。
2）用1％戊巴比妥钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。
沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。
4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红色逐渐变成淡黄白色。
5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。
将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。
Kupffer细胞分离培养
• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
非肝细胞SIP离心准备SIP Nhomakorabea心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。 取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋， 陈琦，等同学。
• 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍， 弃上清(300×g，5min)。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清 （HyClone）。
大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响(医药类)
大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响（医药类）目的观察大鼠肝实质细胞和枯否细胞共培养对其体外生长、形态和功能的影响方法采用原位两步ⅳ型胶原灌注法和高密度离心法分离大鼠肝实质细胞和枯否细胞。
在体外，肝实质细胞和枯否细胞以6∶1的比例共培养。
观察不同条件下肝细胞的存活时间和形态。
培养36 h 后，每隔24 h检测上清液中白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平，用放射免疫法检测上清液中白细胞介素1 (IL 1)、白细胞介素6 (IL 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)的含量。
结果分离培养组肝细胞生长增殖迅速，并向正常肝细胞进化。
肝细胞可以培养并存活15天。
共培养组肝细胞生长和增殖缓慢，可存活10天。
24、36、48和60 h时，共培养组上清液白蛋白水平低于单培养组(t = 2.551 ~ 3.139，P0.05)；24小时、36小时、48小时和60小时血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平高于单独培养组(T = 2.446 ~ 3.108，P0.05)；共培养组的枯否细胞维持il1、il6和tnfα的分泌功能，而单培养组则未检测到il1、il6和tnfα。
结论大鼠枯否细胞和肝实质细胞可以在合适的培养条件下共培养。
这两种细胞能保持良好的分泌功能，可用于实验研究。
[关键词]肝细胞；枯否细胞；共培养技术；白蛋白；细胞因子。
大鼠[摘要]目的观察生长情况。
和肝细胞功能的影响。
方法采用原位ⅳ型胶原酶两步灌注法和超临界流体低速离心法分别分离大鼠肝实质细胞(PHC)和枯否细胞。
PHC细胞和库普弗细胞按6∶1的比例进行体外共培养。
观察细胞在不同条件下的存活时间和形态。
培养上清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶在24小时检测一次，36小时用放射免疫法测定白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的浓度。
结果单独培养组肝细胞生长迅速，发育成正常肝细胞，可存活15天；对于共培养组，细胞生长和生成缓慢，存活10天。
组织巨噬细胞检测方法
组织巨噬细胞检测方法人巨噬细胞可从外周血或经斑蝥激发的皮疱液中获取，也可从肺灌洗液或患者腹膜透析液中分离，但操作繁锁，得量不多。
许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时，常选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，常用的检测方法如下。
（一）炭粒廓清试验正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒医学教|育网搜集整理，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒，据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
（二）吞噬功能的检测巨噬细胞具有较强的吞噬功能，实验室常用比细菌大的细胞性抗原作为被吞噬颗粒，如鸡红细胞。
其检测原理是将受检细胞与适量的颗粒抗原混合后，置37℃保温0.5～1h，其间时加振摇，最后离心取测定细胞制成涂片，染色镜检，分别计数出吞噬百分比和吞噬指数。
各实验室应根据自己的条件建立正常参考值。
（三）巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞富含溶酶体酶，如酸性磷酸酶、非特异性酯酶、溶菌酶等，测定这些酶的活性也是衡量巨噬细胞功能的实用指标之一。
1.酸磷酸酶的测定（1）硝酸铅法：本法优点是用普通试剂，价格便宜，一般实验室均有条件做，封片后可较长时间保存，并可用电子显微镜研究观察细胞的超微结构。
缺点是细胞必需固定，而且固定条件要求严格，如处理不当酶活性易消失，反应步骤也较多。
该法基本原理是在适当的酶性条件下，巨噬细胞内的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸钠水解成磷酸盐后，后者与硝酸铅反应产生磷酸铅，而磷酸铅再与硫酸铵反应则形成黑色硫化铅，沉积在胞浆内酸所在处，显示棕黑色颗粒。
酶活性强弱可根据颗粒的数量和粗细不同而分级判断，颗粒数量少则细的为+，颗粒多而粗的为++，颗粒很多且很粗的为+++.（2）偶氮法：本法操作简便，反应液中的底物α-萘磷酸钠被酸性磷酸酶分解后，形成萘酚和磷酸盐，而萘酚结构中的羟基（-OH）邻近的活泼碳原子，立即与偶氮染料起反应，而产生鲜艳的棕色沉积在酶所在处，缺点是封片后保存时间短。
技术公告 小鼠肝祖细胞类器官的培养方法：补充说明说明书
技术公告小鼠肝祖细胞类器官的培养方法： 补充说明Scientists Helping Scientists ™ |以下是使用HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）（产品号#06030）培养肝类器官的实验流程的补充说明。
有关完整的培养方法，请将该文档与产品说明书（PIS ；文档号 DX21821）配合使用，其中包括完整的材料清单和分步说明，用于从小鼠肝组织中分离出肝导管片段，如何通过Corning ® Matrigel ® dome （凝固液滴）培养肝祖细胞类器官，以及如何对类器官进行团块传代。
下表概述了在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中培养肝祖细胞类器官的可用方案，以及对应的详细方案。
在此表中，Tech Bul . 请参阅本文档（DX27087），而PIS 请参见产品说明书（DX21821）。
目录1肝类器官培养的通用流程 1.1 预先湿润培养器皿 1.2 推荐的接种密度1.3 肝祖细胞类器官的传代时间 1.4 机械研磨和收集类器官片段2 将肝管和类器官解离为单个细胞2.1 将原代肝组织解离为单个细胞2.2 将在Matrigel ® Domes 中培养的肝祖细胞类器官解离为单个细胞3对使用Dilute Matrigel ® Suspension 方法培养的肝祖细胞类器官的构建和传代 3.1 使用Dilute Matrigel ® Suspension 方法构建类器官培养物3.2 对使用Dilute Matrigel ® Suspension 培养的肝祖细胞类器官进行传代4对肝祖细胞类器官进行冻存技术公告1肝类器官培养的通用流程1.1 预先湿润培养器皿与肝管接触的锥形离心管（下文中简称“离心管”）和血清移液管应预先润湿，因为肝管经常粘附在其表面上，从而大大降低了类器官的回收。
实验当天将离心管和移液管预先湿润。
对15mL离心管进行预湿润：首先向该管添加5mL Anti-Adherence Rinsing Solution（产品号 #07010），摇晃以彻底润洗。
小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
Ｏｌｙｍｐｕｓ 光镜下培养 ４ｈ 活细胞已基本贴壁，此时换液 以去除血细胞及死细胞． 肝细．２．２ 采用透射电镜进行肝细胞鉴定，细胞在电镜下均可 见到［１］：肝细胞上有大量微绒毛，细胞间有特征性的紧密连 接以及毛细胆管．胞浆内有丰富的细胞器，如大量内质网，包 括粗面内质网及滑面型内质网，大量的线粒体，其中有典型 的车轮状线粒体，大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器（图 ３）． 4 讨论
的下腔静脉剪断，棉签将胸腔内的血液吸干，切断肝脏周围 的血管，将肝脏移入烧杯；将取下的肝脏移入超净台内，摘 除胆囊，剥离肝脏包膜，用 ２０ｍｌ 培养液将肝脏吹散，混匀液 体用 ２００ 目筛网过滤至另一烧杯内，收集置入离心管中． １０００ 转 ／ 分钟，８ 分钟，弃上清；培养液重悬细胞沉淀，１０００ 转 ／ 分钟，８ 分钟，离心 ２ 次；接种加入 ４０ｍｌ 含有 １０％胎牛 血清和 １％ Ｉｎｓｕｌｉｎ－ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ Ｓｅｌｅｎｉｕｍ 的 ＤＭＥＭ 含双抗 悬浮沉淀，并用吸管充分吹打混匀． 接种于铺鼠尾胶的 ６０ｍｍ 培养皿中． 置于 ３７℃二氧化碳恒温培养箱中静置培 养．４ 小时后换培养液，去掉不贴壁的细胞．以后隔 ２ 天换一 次培养液． 2 细胞鉴定 ２．１ 免疫荧光鉴定
第 ２８ 卷 第 １２ 期（下） ２０１２ 年 １２ 月
赤 峰 学 院 学 报（ 自 然 科 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｆｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ． ２８ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃ ２０１２
小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。
由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。
细菌DNA相对分子质量较大，一般达2×109Da。
因此易被机械张力剪短。
细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA 等。
1.DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。
天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA)。
DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。
RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。
要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。
鉴定血管加压素受体(V1aR)在小鼠肝脏枯否细胞和巨噬细胞中的表达
１ Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｏ ｒ Ｃｏ ｎ ｓ ｅ ｒ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｕｔ ｉ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ ｕ ｂ ｔ ｒ ｏ ｐｉ ｃ ａ ｌ Ａｇ ｒ ｏ ・ Ｂｉ ｏ ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ， Ａｎ ｉ ｍａ ｌ Ｒｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｎａ ｎ ．
Ｃｈｅ ｎ Ｈｕａ ｈａ ｉ ・ Ｓ ｕ ｎ Ｌｏ ｎｇ ｑ ｉ ｎ Ｌｉ ｎ Ｗｅ ｉ ｒ ａ ｎ Ｈｅ Ｆｕｃ ｈ ｕ Ｚｈ ａ ｎ ｇ Ｍｉ ｎｇ
ｌ ａ Ｒ ） ｉ ｎ Ｍｏ ｕ ｓ ｅ Ｌ ｉ ｖ ｅ ｒ
Ｊ ｉ ａ ｎｇ Ｙｉ ｎｇ。
关键 词 血 管加压 素， Ｖｌ ａ Ｒ， 肝脏 枯否细 胞， 巨噬细 胞
Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｙ ｔ ｈ ｅ Ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｖａ ｓ ｏ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖ ｌ ａ Ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ
Ｋｕ ｐ ｆ ｆ ｅ ｒ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ Ｍａ ｃ ｒ ｏ ｐ ｈ ａ ｇ ｅ ｓ
研 究报 告
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｒｅ ｐ ｏ ｒ ｔ
鉴 定血管 加压素 受体 （ Ｖｌ ａ Ｒ ） 在小 鼠肝脏 枯否 细胞 和 巨噬细胞 中 的表达
陈华海 ・ ， ２ 孙 龙钦 ： 林巍 然 ： 贺福初 ｚ 张 明
究中心， 军 事 医学 科 学 院 放 射 与辐 射 医 学 研 究 所 ， 北 京， １ ０ ２ ２ ０ ６
结果表 明在 ｍＲ ＮＡ和 蛋 白质水平 均能检测到 Ｖｌ ａ Ｒ在枯否细胞和 巨噬细胞 Ｒ ＡＷ２ ６ ４ ． ７中的表达 。 同时免疫荧 光 实验 进一 步验证 了 Ｖｌ ａ Ｒ在 巨噬 细胞 Ｒ ＡＷ２ ６ ４ ． ７中的表 达 。总之 ，本研 究 首次鉴 定 到 了血 管加 压素 受体
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3[导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 )【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
小鼠原代肝细胞提取步骤
小鼠原代肝细胞提取步骤1. 引言1.1 背景介绍小鼠原代肝细胞是一种非常重要的细胞类型，可以用于研究肝脏相关的生物学问题。
肝脏是人体最大的内脏器官，具有重要的生理功能，如代谢、解毒、合成蛋白等。
研究小鼠原代肝细胞提取方法对于深入了解肝脏生理功能具有重要意义。
在过去的研究中，科学家们通过提取小鼠原代肝细胞，成功地模拟了肝脏在体内的功能，为肝脏疾病的研究提供了重要工具。
小鼠原代肝细胞也被广泛应用于肝脏细胞培养、药物代谢与毒性研究等领域。
小鼠原代肝细胞的提取方法的改进和优化对于促进相关领域的发展具有积极作用。
通过对小鼠原代肝细胞提取方法进行研究，可以更好地理解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢途径。
优化提取方法，提高细胞纯度和活力，将有助于更精确地进行实验研究，为临床治疗提供更有效的参考依据。
在这一背景下，研究小鼠原代肝细胞提取方法具有重要的意义和应用前景。
1.2 研究意义小鼠是常用的实验动物之一，其肝脏细胞具有一定的再生能力，并且与人类的肝脏细胞在生物学特性上有很多相似之处。
小鼠原代肝细胞提取具有重要的研究意义。
通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地研究肝脏细胞的生长、增殖和功能。
这对于深入了解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢具有重要意义。
小鼠原代肝细胞的提取可以为基因编辑技术、药物筛选等研究提供重要的工具和平台。
通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地模拟体内情况，从而加深对相关疾病的认识、寻找新的治疗方法。
小鼠原代肝细胞的提取对于肝脏生物学研究和药物研发具有重要的意义，有助于推动相关领域的进步和发展。
2. 正文2.1 小鼠原代肝细胞提取前准备工作小鼠原代肝细胞提取前准备工作是成功提取肝细胞的关键步骤之一，其主要目的是为了确保提取到的肝细胞具有较高的活力和纯度。
在进行肝细胞提取前，需要进行以下准备工作：1. 选择合适的小鼠模型：选择健康、年龄相仿的小鼠作为实验材料，确保实验结果的可靠性。
小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养
小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【摘要】为分离、培养高纯度原代小鼠肝实质细胞,并鉴定其纯度及生物活性,试验采用原位两步循环灌流法及多次低速差速离心法分离纯化肝实质细胞,促贴壁培养基原代培养,台盼蓝检测其存活率,PAS反应检测其糖原合成能力,免疫荧光化学检测细胞中CK18表达情况.结果表明:每只小鼠可获取约1.5×106个细胞,存活率>97％;镜下发现细胞在接种后6 h开始贴壁,72 h贴壁细胞生长状态良好,胞体变大、不规则,细胞间相互靠拢呈岛状或条索状连接;肝细胞出现成片紫红色糖原颗粒,CK18在细胞中均匀分布;糖原反应联合CK18免疫荧光显示细胞纯度在90％以上.说明该试验所用方法分离出肝实质细胞数量和存活率高,促贴壁培养基培养的肝实质细胞纯度高,为细胞代谢、细胞毒性等的研究奠定了基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】5页(P7-11)【关键词】小鼠;肝实质细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023【正文语种】中文【中图分类】Q813.11肝脏是哺乳动物机体内重要的解毒和代谢器官［1］。
当肝脏受到物理、化学或生物性损伤时，会产生肝肿瘤、中毒性肝病、肝硬化、急性重型肝炎等各种肝病［2］，而阐明各种肝病的发生机理是预防和治疗肝病、寻找开发新药物的第一步。
目前，将肝细胞分离、纯化并进行体外原代培养已成为探索肝病发病机制常用手段［3］，并在肝病相关研究中起着越来越重要的作用。
肝脏组织样品分离细胞的方法
肝脏组织样品分离细胞的方法1.肝细胞的分离和培养分离方法：1. 肝组织展液的制备将肝组织放在前灌流液(含EDTA0.019％，pH 7．4，一定浓度的抗菌素)中带回实验室，剪去外露明显的血管和胆管组织。
前灌流液(预先在37℃水浴箱中浴热)用BRAUNULE穿刺针从管腔残端灌入，约3—5次，每次20 m1，尽量冲净肝组织中残存的血细胞，见肝组织呈谈红色或淡黄色，后用0．05％的胶原酶IV型水溶液15m1—20 m1，缓慢灌入3—4次，每次约5min—8min，胶原酶IV型可以重复使用，每次使用前均应在37℃水浴箱中浴热以保持酶活力。
待肝组织韧性消失，压迫不易恢复，肝包膜下有时呈粒状时，放入平皿中、用眼科镊剪去除被膜及肝组织内肉眼可见的管道系统，然后连同灌注流出的胶原配溶液放入锥形瓶中，在37℃水浴箱中振荡消化10min。
用培养液终止反应制成混合肝细胞悬液。
2. 分离培养肝细胞取混合肝细胞悬液用200目尼龙布过滤，50×g离心3min。
留下上清液作分离肝窦状间隙的内皮细胞用。
用1640培养液反复离心3次，每次50×g离心3min，以清洗残存的胶原酶和纯化肝细胞，在显微镜下观察肝细胞形态及纯化状态；用0.4％锥兰染色判断细胞活率，血细胞计数板计数细胞浓度。
以1640合成培养基(含10％AB型人血清)细胞混悬液稀释至2×l0E5／m1后分别接种在培养瓶和六孔培养板上。
在37℃、5％CO2条件下先培养l 8h—20 h，换液去除残存血细胞，再用同样培养基培养7d一10d。
2.间质细胞的分离和培养a.肝寨间隙内皮细胞分离、培养：取分离肝细胞后的上清液，用50×g离心3min和500×g离心5min交替离心3—5次，去除残存的肝细胞，同时用1640培养液清洗残存的胶原酶。
分出的细胞主要为肝内皮细胞和枯否氏细施的混合悬液。
用0.4％锥兰染色判断细胞活率后，接种在培养瓶中。
小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用与制作流程
图片简介:本技术提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。
小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。
技术要求1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。
三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；优选地，所述PBS的温度为36-37℃；优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。
4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。
小鼠肝脏细胞原代培养
1瓶
RPMI1640培养液 1瓶
废片缸
1
（四）实验步骤
1.75%酒精棉球擦拭超净台，将试验所 需试剂、耗材等置于超净台中紫外照 射30min后，关闭紫外灯打开照明，通 风15min。
2.取一只小鼠置于含乙醚的废片缸中使 其麻醉，脱臼处死，75%酒精中浸泡并 移置于超净工作台内，将小鼠放在无 菌平皿中，用手术剪和镊子撕开腹部 皮肤，再换一套手术剪和镊子剪开腹 膜暴露内脏。
3.取另一无菌平皿，倒入少许PBS置于 一旁备用 4.用镊子取出肝脏置于含有PBS的无菌 平皿内,清洗2次，除去杂物后，用手术 剪将肝脏剪成1mm³小块。
组织块法：
用镊子夹取组织块并将其转移到克氏 瓶底部，组织块之间有一定间隔（5mm 左右），等组织块粘在克氏瓶上不滑动， 将培养瓶翻转180度组织块朝上，加入 2ml含10%胎牛血清DMEM培养液，盖上 瓶盖，做好标记，37℃ 5% CO2培养箱中 静置培养4小时后待组织块完全粘在克氏 瓶上轻轻翻转克氏瓶，使组织块浸入培 养液中，隔天换一次液，观察细胞是否 贴壁。
3.吸取上层清液加入到1.5mlEP管中， 配平，800rpm，10min，离心。离心 后弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打 混匀，1000rpm离心10min，弃上清， 加入RPMI1640(10%胎牛血清)1ml重悬， 吸取20μl加入到含等体积0.4%台盼蓝 的1.5mlEP管中，混匀吸取20μl血球计 数板计数。
1.组织块法: 2.消化法:细胞数:
将细胞浓度调整到2*106个/ml， 细胞稀释 倍
细胞生长状态: 培养基颜色: 更换培养基次数:
（六）注意事项
1.工作台面上在实验前要用酒精棉擦， 用品要布局合理。 2.用过的培养瓶、离心管等需及时清洗。 3.实验结束后及时清洗用过的玻璃器材、 收拾台面、倒垃圾。
小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法
第30卷第1期2010年1月国际病理科学与临床杂志 htt p://www .gjbl .netI nternati onal Journal of Pathol ogy and ClinicalMedicineVol .30 No .1Jan . 2010收稿日期:2009-10-09 修回日期:2010-01-23作者简介:赵秀华,硕士研究生,主要从事成体干细胞的研究。
通讯作者:程腊梅,E 2mail:chenglamei2000@yahoo .com基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2007CB947900);湖南省自然科学基金重点项目(08JJ3075)。
The work was supported byNati onal Key Basic Research and Devel opment Pr ojects (2007CB947900)and Key Pr ojects of Natural Science Foundati on of Hunan Pr ovince,P .R.China (08JJ3075).・Arti cles ・・论 著・小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法赵秀华,罗彬,罗盘,程腊梅(中南大学生殖与干细胞工程研究所,长沙410078)[摘要] 目的:建立小鼠肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells,LSEC )的分离培养方法,研究其生物学特性。
方法:中性蛋白酶消化小鼠肝脏组织,Percoll 密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞筛选培养基及酶差异消化法纯化LSEC;免疫细胞化学染色检测LSEC 的表面标志,分析LSEC 的超微结构,观察D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l ow density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )摄取能力,以体外成血管能力分析LSEC 的功能。
小鼠肝Kupffer细胞使用说明
小鼠肝Kupffer细胞小鼠肝Kupffer细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠肝Kupffer细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠肝Kupffer细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠肝Kupffer细胞产品简介：产品名称：小鼠肝 Kupffer 细胞（Mouse Hepatic Kupffer Cells）组织来源：小鼠肝组织产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶小鼠肝Kupffer细胞细胞简介：小鼠肝 Kupffer 细胞分离自小鼠肝脏组织，细胞呈圆形或多角形。
Kupffer 细胞是位于肝窦内表面的吞噬细胞，能够清除血液中的外来抗原、抗原－抗体复合物和细胞碎片等物质。
Kupffer 细胞是全身单核-吞噬细胞系统的重要组成部分，也是肝脏防御系统主要成员，在全身和肝脏疾病发生发展中起到重要作用。