红曲霉菌微胶囊化培养

红曲霉菌微胶囊化培养3张子儒　郑巧东　姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程学系,杭州,310027)摘　要　采用NaCS 2PDMDAAC 微胶囊对红曲霉菌进行了固定化培养试验,在进行连续6批的培养中发现,红曲霉菌可以很好地在NaCS 2PDMDAAC 微胶囊生长和产红曲色素。

与游离培养细胞的比较表明,微囊化培养的糖耗时间会远远少于游离培养,红曲色素的浓度在前3批略低于游离培养,一但达到稳定后,就会高于游离培养。

同时也表明,微囊化培养时红曲霉菌的浓度远远大于游离培养。

关键词　红曲色素,NaCS 2PDMDAAC 微胶囊,细胞固定化,红曲霉菌　第一作者:硕士研究生。

3国家自然科学基金资助项目(No.20276065)　收稿时间:2003-08-06 生物微胶囊是一种新兴的细胞固定化技术[1～3]。

纤维素硫酸钠(NaCS )2聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDMDAAC )生物微胶囊是一种在1980年代被开发的固定化技术,近年来在微生物固定化培养上有不少成功的应用[4～7]。

与其他固定化体系相比,NaCS 2PDMDAAC 微胶囊膜层较薄(20～100μm ),机械强度较高,生物相容性良好,传递和截留性质适宜以及物化性质稳定。

更重要的是,该体系制备方法简单,只需一个步骤即可完成,大大减小了染菌的机率。

红曲色素是一种天然的染色剂和防腐杀菌剂,红曲霉菌发酵液中还含有多种生理活性物质,具有降胆固醇和降血压的功效[8]。

红曲色素是一种次级代谢产物,长期以来都是采用大米固态发酵法,尽管产量较高,但劳动强度大,效率低,不适合于大规模工业生产,而现在国内外使用的液态发酵法的红曲色素产量低,发酵周期仍然很长[9]。

如果采用微囊化培养,可以在保持现有发酵条件的基础上,缩短发酵周期,提高红曲色素产量,从而显著提高生产效率。

我们在前期的工作中,曾多次采用NaCS -PDMDAAC 微胶囊体系进行一些初级代谢产物的发酵培养,如乙醇、乳酸、谷氨酸、纳豆激酶等[5～6],而本文将把该微胶囊体系用于红曲霉菌的固定化培养,通过模拟红曲霉的固态发酵环境,来了解该微胶囊体系在固定化培养生产次级代谢产物时微生物在微胶囊内的生长繁殖和代谢规律。

1　材料与方法1.1　实验材料1.111　菌　种红曲霉菌(Monascus purpureus ),购自浙江省微生物研究所,经本实验室筛选后使用。

11112　培养基(g/L )葡萄糖3010,NaNO 3310,酵母提取物110,MgSO 4・7H 2O 015,K 2HPO 4・3H 2O 110,FeSO 40101和KCl 015。

11113　微囊化材料NaCS 由本实验室自制,PDMDAAC 购自美国Aldrich 公司。

112　实验方法11211　红曲霉菌的培养将活化的红曲霉菌接入试管斜面,30℃下培养8d 。

然后用10mL 无菌水从斜面洗下孢子接入种子培养液,在往复式摇床中报告30℃,160r/min下培养24h后,将同一种子液分别接入游离和固定化发酵瓶中。

11212　红曲霉菌的微胶囊化配制315%的NaCS和210%PDM2 DAAC溶液,灭菌后待用。

在无菌条件下,将一定量的红曲霉种子液与NaCS溶液混合,滴入PDMDAAC溶液中,磁力搅拌固化90 min左右,制成微囊化红曲霉菌。

11213　微囊化红曲霉菌的多批次培养将30mL微囊化红曲霉菌接入含有90 mL发酵培养基的500mL摇瓶中,在摇床中30℃,160r/min下培养,定时取样分析培养基中残糖浓度和红曲色素浓度。

在糖耗尽后24h左右更换培养基,同时取出一定量微胶囊用于红曲霉菌生物量的分析。

重复培养6批。

11214　红曲霉菌体的收集取出的微胶囊经过机械破碎后,用砂芯漏斗抽滤,以去离子水洗涤数次后装入具塞试管中,放入烘箱内烘干备用。

11215　红曲霉菌体中氨基葡糖的释放[10]将烘干的待测样每管加2mL60%的H2SO4,25℃浸泡24h后,稀释至H2SO4终浓度为1mol/L,置于250mL三角瓶,0198 MPa高压下加热1h,冷却后用1mol/L NaOH中和至p H710,定容到100mL待测。

113　分析方法葡萄糖:用DNS法测定。

红曲色素:用比色法测定。

Ultra2 spec3300pro全光谱扫描发酵上清液,取500 nm处的吸光值来表征红曲色素浓度。

生物量:游离细胞生物量用干重法直接测定。

固定化细胞生物量通过测定红曲霉菌体细胞中的氨基葡糖含量来推断[11]。

氨基葡糖测定法[12]:用Elson2Morgan 法测定。

2　结果与讨论211　微囊化的第1批培养与游离培养的比较为作比较,在进行固定化培养的同时也进行了游离细胞培养,图1为红曲霉菌的第1批微囊化细胞培养和游离培养的结果。

图1　红曲霉菌游离和微囊化第1批发酵比较从图1中可以发现,第1批微囊化细胞培养与游离培养具有相似的产物积累和糖耗过程,葡萄糖和红曲色素浓度与时间的关系都呈现与微生物游离培养规律相同的“S”型,表明微囊化对红曲霉菌的生长和产物生产没有影响。

在红曲霉菌的微囊化培养过程中,葡萄糖耗尽时间比游离培养时缩短了24 h。

从这个结果我们可以推测,在微囊化细胞培养中,微胶囊既能给细胞提供一个良好的液态环境,也能提供一个支持壁和保护体系,可以让细胞与培养环境之间较好地进行能量与质量交换。

同时由于胶囊膜的保护,可以防止由于剪切力的作用而使菌丝体切断,由此增加了发酵细胞密度,使糖耗时间缩短。

而在其他微生物,如大肠杆菌、酵母的培养中[5,6],由于这些微生物不存在菌丝受剪切力的影响,所以其第1批微囊化培养的糖耗时间与游离培养几乎一致。

同时从图1中还能看到,在培养第1批微胶囊化细胞时,由于细胞在经历了微囊化过程后有一个适应过程,红曲色素的产量比游离培养低。

但随着微囊化培养的重复进行,结果将得到明显改善。

212　微囊化红曲色素的分批重复培养红曲霉菌的第1批微囊化培养结果表明,微囊化培养在产红曲色素方面并不优于游离培养,但是在换入新的培养液并进行后食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol129　No111究报告图2　微囊化红曲霉菌第1、2和第4批发酵曲线续发酵时,红曲色素的产量就会逐步改善。

我们共进行了连续6批的微囊化培养。

图2中示出了第1、第2和第4批糖耗和红曲色素产量随时间的变化规律。

可以发现,糖耗时间越来越短,到第4批时,已从游离细胞培养的70h降到12h,而红曲色素浓度随着发酵的进行则越来越高。

在第1和第2批发酵时,红曲色素浓度还低于游离培养,但到第4批时,发酵液中红色素浓度已经超过了游离培养时的结果。

其主要原因在于,固定化体系为红曲霉菌的生长提供了良好的条件,使得在微胶囊内聚集了超过游离培养多倍的菌体浓度。

从图2中可以看出,每批次最终产物浓度依次升高,而糖耗也逐步加快,第4批后糖耗速率基本稳定,但红色素的产量还在不断上升。

从第2批开始,尽管葡萄糖在24 h已经基本被消耗尽,但红色素积累还需要一定的时间,因此从第2批开始,换液时间一般控制在48h左右。

213　微囊化红曲霉生物量的氨基葡糖法测定红曲霉菌菌丝发达,与微胶囊内壁紧密结合在一起,采用机械法破碎后,很难除去胶囊碎片,所以无法用干重法来直接测定红曲霉的生物量,因此只能用间接法来关联。

从相关报道的结果[13～14]看,通过测定细胞中的特殊物质,如氨基葡糖的含量来推测生物量比较准确、易行。

在红曲霉菌菌丝体中,氨基葡糖是细胞中的一种特殊物质,当红曲霉菌达到稳定期后的一段时间内,其细胞中的氨基葡糖含量基本上保持一定的值,因此只要测定收集的红曲霉菌菌丝体中的氨基葡糖含量就能关联到相应的菌体干重。

图3　红曲霉菌体中氨基葡糖含量葡萄糖耗尽后,在不同时刻从若干平行样中取出菌丝体,测定氨基葡糖含量,得到了如图3所示的结果。

从中可以看出,红曲霉菌菌体中的氨基葡糖含量与菌体量成正比。

同时还采用氨基葡糖法测定了每批次发酵终点的生物量浓度,示于图4中。

从中可以发现,每批微囊化培养后,红曲霉菌菌浓都有不同程度的增长,在第5批时达到了1314g/L(发酵液),而普通游离培养的细胞浓度只有512g/L(发酵液),但在第6批时略有下降。

同时,随着菌浓的积累,红曲色素的产量也不断上升,在第6批也有一个突然的下降过程。

图4　微囊化红曲霉菌重复培养菌干重和红曲色素产量曲线3　结　语在固定化红曲霉菌的第1批发酵中,由报告于胶囊的保护和支撑作用,囊内的菌丝体不但浓度高于游离培养,并且避免了剪切力的破坏而更加完整,因此葡萄糖消耗更快。

但是细胞对固定化体系需要一个适应过程,随着一批又一批发酵的进行,除了囊内菌浓继续增加外,糖耗也在缓慢加快,这时的红曲色素产率已经远高于游离时的水平。

但是由于细胞浓度的增加,为了保证发酵液中的溶氧水平,摇床的转速必须有所加快。

在这样的情况下,有可能会对微胶囊产生破坏作用,影响培养的继续进行,如在第6批培养时,胶囊出现一定程度的破碎说明了这一点。

这些结果充分说明,对于霉菌类微生物,微囊化培养是一个很好的选择,而且微胶囊培养也完全适用于次级代谢产物的生产,但要适当控制好时间。

这同样也给我们一个启示,在好氧微生物的微囊化培养中,要注意氧的供给,加快摇床转速并不是一个最佳选择。

在大规模微囊化培养时,应注意生物反应器的选择。

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