兔关节滑膜细胞的分离、培养和纯化

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医学细胞生物学

兔关节滑膜细胞的分离、培养和纯化＝
Ｉｏａｏｓｌｔｎ，ｃｌｖｔｎａｄｐｒｆａｏｆｉｕｔａｉｉｏｎｕｉｔｎｏｉｃｉ
ｒｂｉａｔｕａｙｏｉｅｌ［，中］ａｂｔｒｃｌｓｎｖａｃｌ刊ｉｒｌｓ／黄世峰（南方医科大学动物实验中心，广州５０１）肖长虹，顾为望，张嘉宁，１５５，
关键词：医学细胞生物学；人红细胞保存；冰冻干燥；聚乙烯吡咯烷酮；葡萄糖
ＯＯ１３７７Ｏ９３０・１１７
清Ｎ含量均显著高于对照组均＜Ｏ
００）．１，术后各时间点红花组与肝素组血浆ＥＴ含量比较差异均无显著性；后术３ｄ和７ｄ红花组血清ＮＯ含量均显著高于肝素组均＜００）．１，术后１ｄ和１５ｄ两组比较差异均无显著性．家兔股动静脉内瘘术后ＥＴ增多，ＮＯ减少，存在血管内皮功能失调；红花注射液通过调整术后ＥＴ和ＮＯ的平衡，可改善血管内
冰冻干燥（冻干）保存人红细胞在临床输血和战伤救治方面具有重要意义．一些研究表明糖类能提高细胞膜的耐干燥性．试验采用葡萄糖和聚乙烯吡咯烷酮（ｖ）ＰＰ作为主要保护剂进行红细胞的冻干保存研究．首先对影响红细胞葡萄糖
ｏｅａｏａｂｔ刊，中］蒋宇峰（ｐｒｔｎｉｒｂｉｉｎｓ［／上海中医药大学附属曙光医院，上海２０２）００１，何立群，沈沛成中国中西医结合急救杂志．２ｏ，１（）３５一ｏ６３６．４～一

CCK8实验

CCK8实验具体操作步骤：1.将昨日铺的96孔板拿出，在操作台上用直吸管将铺有细胞的60个孔里面的上清液全部吸掉，再加PBS200ul洗一次，最后将96孔板里面所有的液体全部吸掉。

2.96孔板加药：先加药-----再加无血清培养基-----最后再加PBS3.全部加完后，放于混匀振荡器上振荡3分钟。

4.最后放入培养箱中继续过夜培养。

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养文章来源：2006-7-19 14:41:08兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养第二军医大学学报2000年第21卷第3期徐青镭吴海山周维江摘要目的：评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程重建中种子细胞的可能性。

方法：采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养，并研究其增殖及生长特征。

结果：原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。

结论：兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻，用作半月板组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。

关键词：间充质干细胞；骨髓；半月板骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有多量的间充质干细胞（MSC）。

如同多能造血干细胞的存在赋予骨髓组织以强大的造血功能以维系血液系统的新陈代谢一样，这些MSC的存在为骨软骨组织的损伤提供了潜在的修复能力。

但是与造血干细胞相比，骨髓中MSC的含量并不丰富。

本实验拟通过体外细胞培养的方法将MSC自骨髓血中分离出来并加以纯化，并进一步在体外培养条件下研究其增殖及生长特性，从而探讨为半月板的组织工程重建提供种子细胞的可能性。

1 材料和方法1.1 兔骨髓MSC的分离取成年新西兰兔10只，6个月龄，雌雄不拘，平均体质量3.2 kg (2.8～3.7 kg）；用3%戊巴比妥钠按1 mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5 ml注射器，内含3000 U/ml 的肝素0.1 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心180×g，5 min；弃去上清液，沉淀用Ham f12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保留10 min，取出再离心180×g，5 min；弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细胞量达106～107后，即可进行原代培养接种用。

兔软骨细胞的分离

目的探讨兔软骨细胞培养方法。

方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。

每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。

并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。

结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。

甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。

结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。

软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。

1材料与方法1·3动物: 4周龄健康新西兰兔。

1·4软骨细胞的分离和培养1·4·1软骨细胞的分离步骤:I)一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机物污染。

(30min) II)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台III)在超净工作台作如下操作:1)先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。

2)用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。

3)充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。

4)用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。

5)加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙网筛过滤。

6)所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。

滑膜取材

大鼠滑膜取材
1、造模分数达到最高峰，将大鼠脱颈处死，消毒，仰面固定，沿膝关节为中心的区域，用镊子提起髌骨，沿髌骨上沿约0.3-0.4cm处向下切割至股骨，再分别沿着髌骨两侧分离至胫骨，然后在体视镜下使用显微镊显微剪从关节腔中分离滑膜组织。

2、立即将滑膜组织浸泡在含有双抗的D-hank液里洗四次，用显微剪将脂肪组织去除，并将组织反复剪成1cm3左右的小块，加入配置好的含有0.4％II型胶原酶培养基置于37℃培养箱内消化2h，将未贴壁的细胞移入离心管内，1500rpm离心10min。

3、弃上清，加入4ml 0.25无EDTA胰酶37℃消化30min，期间每10min 吹打一次，将细胞消化开，加入8ml完全培养基终止消化，1500rpm 离心10min，弃上清。

4、加3ml完全培养基悬浮细胞，200目不锈钢筛网过滤细胞，在加入2ml完全培养基冲洗离心管中的细胞，用6cm培养皿培养。

配制0.4％II型胶原酶（4mg/ml）。

称200mg II型胶原酶溶于25ml的D-hanks中，在加入25ml完全培养基配制。

滑膜细胞提取方法

滑膜细胞提取方法滑膜细胞是滑膜内层的细胞，主要负责滑膜的滑液分泌和关节的润滑作用。

滑膜细胞提取是一种重要的实验技术，可以用于滑膜细胞的研究和应用。

下面将介绍滑膜细胞提取的方法。

1.机械法：（1）将滑膜组织取出，并清洗去除外层的脂肪和结缔组织。

（2）将滑膜组织切成小块，并加入适量的胶原酶或胰酶等消化酶。

（3）将样品放入温育箱中，用37℃恒温摇床摇动静置。

（4）消化酶作用一定时间后，将细胞悬液通过0.22μm滤膜过滤。

（5）收集滤液中的细胞，用离心机进行离心。

（6）最后将细胞沉淀物用PBS缓冲液洗涤数次，即可得到提取的滑膜细胞。

2.消化法：（1）将滑膜组织取出，并清洗去除外层的脂肪和结缔组织。

（2）将滑膜组织切成小块，并加入适量的胶原酶或胰酶等消化酶。

（3）将样品放入温育箱中，用37℃恒温摇床摇动消化。

（4）消化一定时间后，将消化液通过滤膜过滤，收集滤液中的细胞。

（5）将细胞悬液用离心机进行离心。

（6）最后将细胞沉淀物用PBS缓冲液洗涤数次，即可得到提取的滑膜细胞。

以上是常用的滑膜细胞提取方法，其中，机械法主要是利用机械力来破坏滑膜组织的结构，使细胞能够被释放出来；消化法则是通过消化酶来降解滑膜组织的胶原纤维和细胞外基质，从而将细胞释放出来。

两种方法各有优缺点，实验者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。

总体来说，滑膜细胞提取方法相对简单，但在实验中仍需注意以下几点：（1）滑膜组织的取材应尽量避免外部的污染，以及避免对滑膜组织的过度损伤。

（2）消化时间需根据具体消化酶的活性和滑膜组织的坚硬程度进行优化，消化过久或过短都可能会影响细胞提取的效果。

（3）滑膜细胞处理过程中应注意细胞的保存和培养条件，如保存在低温条件下、无菌环境中，以免细胞失活或受到污染。

总之，滑膜细胞提取方法是一种重要的实验技术，合理选择和优化提取方法能够提高细胞提取的效率和质量，为滑膜细胞相关的研究和应用提供可靠的实验基础。

临床医学检验考试技术(师)(习题卷2)

临床医学检验考试技术(师)(习题卷2)说明：答案和解析在试卷最后第1部分：单项选择题，共100题，每题只有一个正确答案,多选或少选均不得分。

1.[单选题]属于器官特异性自身免疫病的一种，最先出现的症状是眼肌无力，进而累及其他部位，常呈进行性加重，抗乙酰胆碱受体抗体检测呈阳性反应，这些症状最符合的疾病是A)肌萎缩侧索硬化症B)重症肌无力C)系统性红斑狼疮D)类风湿关节炎E)干燥综合征2.[单选题]下列关于新型隐球菌的描述，错误的是A)菌体圆形，外包厚荚膜B)在沙氏培养基上形成酵母型菌落C)常引起慢性脑膜炎D)营养丰富时可产生假菌丝E)标本可直接用墨汁负染后镜检3.[单选题]AIDS属于哪种免疫缺陷病A)原发性吞噬细胞缺陷病B)原发性联合免疫缺陷病C)原发性B细胞缺陷病D)原发性T细胞缺陷病E)获得性免疫缺陷病4.[单选题]淋巴细胞活力的表示常用A)活细胞占总细胞的百分比B)活细胞浓度C)淋巴细胞浓度D)活细胞与总细胞的比值E)白细胞浓度5.[单选题]ICSH推荐的血红蛋白参考测定方法是A)SDS测定法B)HiN3测定法C)碱羟血红蛋白测定法D)CTAB血红蛋白测定法E)HiCN测定法6.[单选题]下列哪种细菌常引起社区获得性肺炎（）A)流感嗜血杆菌B)大肠杆菌C)军团菌D)支原体E)铜绿假单胞菌7.[单选题]最主要致病物质是Vero细胞毒素的细菌是A)小肠结肠炎耶尔森菌B)空肠弯曲菌C)霍乱弧菌D)伤寒沙门菌E)O157：H7大肠埃希菌8.[单选题]患者，女，42岁，因SLE并发肾功能衰竭而入院治疗，采用激素冲击疗法，连续应用激素1周。

该患者的肾衰有所缓解，但却出现发热、咳嗽、气喘等呼吸系统症状，听诊肺部有啰音若该患者咳痰为黄脓色、粘厚，可能感染的细菌是A)铜绿假单胞菌B)乙型溶血性链球菌C)金黄色葡萄球菌D)肺炎链球菌E)肺炎克雷伯菌9.[单选题]红细胞对血沉的影响，正确的叙述是A)红细胞增多症可见血沉加快B)红细胞直径越大，血沉越快C)球形红细胞使血沉加快D)贫血对血沉无影响E)镰形红细胞使血沉加快10.[单选题]类风湿因子的靶抗原是A)IgGB)IgMC)IgAD)变性IgGE)C311.[单选题]适应性免疫应答A)具有特异性B)吞噬细胞是主要效应细胞C)可遗传D)时相是在感染后数分钟至96hE)先天获得12.[单选题]下列不具有吞噬功能的细胞是A)嗜碱性粒细胞B)中性粒细胞C)单核细胞D)嗜酸性粒细胞E)巨噬细胞13.[单选题]血型鉴定时若红细胞出现缗钱状，采用最佳的措施是A)用5％红细胞悬液鉴定血型B)用新鲜制备的标准血清鉴定血型C)在37℃下进行血型鉴定D)将被检者红细胞用生理盐水洗涤后鉴定血型E)用10％红细胞悬液鉴定血型14.[单选题]最适宜用于鉴别原粒和原淋的细胞化学染色是A)过氧化物酶B)糖原C)碱性磷酸酶D)α-丁酸萘酚酯酶和氟化钠抑制试验E)酸性磷酸酶15.[单选题]用于研究蛋白质相互作用的经典方法是A)免疫层析试验B)酶联免疫斑点试验C)免疫印迹法D)放射免疫沉淀试验E)斑点酶免疫吸附试验16.[单选题]脑脊液可呈黄色胶冻状，常见于下列何种疾病A)结脑B)化脑C)脊髓灰质炎D)蛛网膜下腔梗阻E)流行性乙型脑炎17.[单选题]临床血气分析时标本的采集和保存不正确的是A)肝素抗凝B)隔绝空气C)立即分析D)采集动脉血和静脉血均可E)测定前将血液混匀18.[单选题]均值为3.5，标准差为0.5，某测定值为5.0，“Z计分”值就为A)1B)-1C)3D)0E)-219.[单选题]关于尿液干化学法检查，错误的是A)干化学法既可对完整的RBC反应，又能测定游离的血红蛋白量B)不同型号试纸带的敏感度不同，使用时应注意批间差异C)尿中含有易热酶、肌红蛋白或菌尿可引起假阴性D)尿糖的测定原理是葡萄糖氧化酶，过氧化物酶法E)大量维生素C时可干扰试验结果引起假阴性20.[单选题]小细胞低色素性贫血最常见于A)再生障碍性贫血B)白血病C)急性溶血性贫血D)缺铁性贫血E)铁粒幼细胞性贫血21.[单选题]分化好的原始单核细胞呈阳性反应，分化差的原始单核细胞呈阴性反应，幼稚及成熟单核细胞呈阳性反应，阳性反应能被氟化钠抑制。

痛风泰颗粒对兔滑膜细胞IL-1β和TNF-α表达的影响

泌ＩＬ一１Ｂ和ＴＦ一的影响，Ｎ来探究其治疗痛风性
：兰：
墨堕杂２１第６第期ｗｉｏａｆｔｔＴｄｄ。ｒＭｉ。２。，．主堕合志０年卷２。ｕｌｅｅｒｔ１ｎ。ｉ０，１Ｎ２１ｒＪｒ。ｎｇｄａｉｗｔｄ１ｖ．。ｄｎＩｍｉ。。。１６
ＴｏｇｅｇａｒｎｕｅｎｈｂｔｓｇｉｃｎｌｈｘｅｓｏｓｏＬ一１ＢａｄＴＮＦ一ｉｙｏｉｃｔｆｒｂｔｎｆｎｔｉｇａｌｓｉｉｉｉｎｆａｔｙｔｅｅｐｒｓｉｎｆＩｉｎｎｓｎｖｏｙｅｓｏａｂｉｉｄｕｅｙＭＳ，ｎｃｔｎｈａｏｇｅｇａｒｎｕｅｒｆｅｔｅｏｏｔｔｒｕｇｔｎｈｂｔｏｎｔｅｒｌａｅｎｃｄｂＵｉｄｉａｉｇｔｔｔｎｆｎｔｉｇａｌｓａｅｅｆｃｉｎｇｕｈｏｈｉｓｉｉｉｉｎｏｈｅｅｓｖ
痛风泰颗粒对兔滑膜细胞ＩＬ一１Ｉ３和ＴＦ—Ｏ表达的影响ＮＬ
张剑勇刘题章
【要】目的摘
邱侠于丽钟力黄华
观察痛风泰颗粒对尿酸钠（Ｕ）ＭＳ诱导的兔膝滑膜组织中白细胞介素一１（Ｌ一ｐＩ
取３只实验兔分别空腹灌胃生理盐水、风痛
现白细胞介素一１；ｐ肿瘤坏死因子一ｏｔ
ＩａｔｏｏｇｅｇａａｕｅｎｔｅＥｐｅｓｎｆＬ一１ｎＮｍｐｃｓｆｎｆｎｔｉＴＧｒｎｌｓｘｒｓｉｓｏｏｈｏＩａｄＴＦ— ｐ

原代细胞分离培养鉴定1(SD 大鼠颅骨成骨细胞、兔关节软骨细胞)

原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠颅骨成骨细胞、兔关节软骨细胞）目录 1 原代分离——SD 大鼠颅骨成骨细胞的分离2 原代分离——兔关节软骨细胞的分离1、SD 大鼠颅骨成骨细胞的分离目的与意义体外培养成骨细胞是研究骨代谢和成骨机制的重要手段，成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。

随着组织工程学的发展，成骨细胞的体外培养已成为骨组织工程体外构建研究的基础。

此外，培养的成骨细胞多取材于动物的骨和骨膜组织。

颅骨人体中：头骨（又名颅骨）：按颅骨所在的部位，B 颅骨分为脑颅和面颅两部分，通常以经过眶上缘和外耳门上缘的连线为分界线。

大鼠：头骨包括颅骨和面骨，颅骨包括：枕骨1块，顶间骨1块，顶骨2块，额骨2块，颞骨2块，基蝶骨1块，前蝶骨1块，筛骨1块。

AC6 成骨细胞成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。

成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。

成骨细胞增殖期时其数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。

骨切片HE 染色成骨细胞短柱状,有突起,核圆形,细胞质强嗜碱性，在将要形成骨组织的地方，排列成单层，彼此由突起相连 D E F分离方法文献方法注意事项1、选择出生24 h内大鼠乳鼠取颅骨, 否则骨组织难以消化；2、取颅骨时应注意剔除骨膜、骨缝中结缔组织及颅顶透明软骨结节, 以减少杂质细胞的污染；3、首次消化液弃去以减少首先消化下来的成纤维细胞、破骨细胞、骨祖细胞等的污染；4、注意消化传代时机, 最好待细胞生长至单层融合时即传代。

传代过早, 细胞数目稀少, 不易生长;传代过晚, 细胞提前分化、衰老, 分泌骨基质；5、传代后可采用差速贴壁法进一步纯化成骨细胞, 因为混杂的成纤维细胞先贴壁, 所以传代后静置 30min, 此时成纤维细胞已经贴壁, 然后轻摇培养瓶, 将仍未贴壁的成骨细胞接种至另一培养瓶；6、适度的消化；7、原代培养容易污染, 应严格无菌操作；参考：刘长剑, 刘建国, 于铁成, et al. Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞[J]. 中国老年学杂志(06):525-527.断头︐取颅骨︵顶骨︶1234 5剥除骨膜，去软骨6 7 剪切，初次消化8 9 二次与后期消化100倍形态多样，呈三角形、梭形、多角形等不规则形，细胞伸展，有长短不一的突起，呈复层生长。

滑膜间充质干细胞分离纯化后的生物学特性

国家自然科学基金青年科学基金项目（８１０００７９８）＊，课题名称：兔自体滑膜间充质干细胞修复重建半月板损伤的机制研究
摘要ｒａｅａｇｌｅ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ背景：大量的研究报道证明滑膜间充质干细胞在细胞形态、免疫表型、集落形成能力和分化潜能等方面与骨通讯作者：昊宇黎，副主髓间充质干细胞相似，但在向软骨分化的能力上，滑膜间充质干细胞明显优于骨髓间充质干细胞。任医师，上海市长征医院目的：探讨滑膜间充质干细胞作为半月板软骨组织工程种子细胞的可行性。关节外科，上海市方法：通过有限稀释单克隆培养法将滑膜间充质干细胞从兔滑膜组织中分离出来并加以纯化，在体外培养条２００００３件下对其形态学、超微结构、分子表型、增殖动力学、核型以及致瘤性等进行分析。ｗｕｙｕｌｉ６０１９＠１８９．ｃｎ结果与结论：从兔滑膜细胞中分离纯化出滑膜间充质干细胞，体外单层培养具有极强的增殖能力，在第６天Ｒ３１８时达到生长的最高峰，倍增时间为（３０．２＋２．４）ｈ。流式细胞术检测滑膜间充质干细胞表达间充质干细胞一些分中图分类号：文献标识码：Ａ子标记ＣＤ４４、ＣＤ９０。ＤＮＡ含量检测、染色体核型分析、荷瘤实验结果表明，分离纯化的滑膜间充质干细胞文章编号：２０９５－４３４４是正常的二倍体细胞，无致瘤性，因此可作为半月板组织工程的种子细胞。（２０１３一）４１・０７２２１ — ０７

SH关节腔内注射治疗兔膝关节炎的实验研究

SH关节腔内注射治疗兔膝关节炎的实验研究【关键词】透明质酸钠摘要：［目的］探讨透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）关节腔内注射治疗膝骨性关节炎（OA）的效果。

［方法］24只兔子建立骨关节炎动物模型，随机分OA组、SH组、对照组，观察3组软骨、滑膜细胞病理切片及软骨MMP1免疫组化，进行软骨Mankins评分，以及检测血液和关节液的IL1含量的效果。

［结果］SH组可见软骨破坏减轻，滑膜纤维增生减少，Mankins评分有明显改善（P＜005）；血、膝关节滑液IL1浓度降低（P＜005），但关节软骨中MMP表达仍然活跃。

［结论］SH能减少滑液中炎性介质IL1的分泌，从而减轻滑膜炎症，缓解对软骨细胞的破坏，延缓OA进展，但仍阻止不了OA进展。

关键词：透明质酸钠；骨关节炎；滑膜炎；白介素1; 金属蛋白酶1 Abstract：［Objective］To observe the effects of intraartieular sodium hyaluronate injection on treatment of rabbit Osteoarthritis(OA)［Method］Twentyfour male rabbits were randomly divided into SH group,OA group and control group after established the model of OA,SH group，and control group were received intraarticular SH and physiologic injection one time a week at the same time respectivelyThe histological examinations of cartilage and synovia,immunohistochemistry of MMPl for cartilage,Mankin s scale were performedThe levels of IL1 of the serum and synovial fluid were determined by ELISE［Result］In the SH group showed the degeneration of the cartilage and fiber hyperplasia of synovia were light ened in the histological observation and the level of interleukin-1(IL1)of the serum and synovial fluid were also decrease（P＜005）The Mankin s scale of the control group was significantly decreased（P＜005）The expression of MMP1 of SH group was active［Conclusion］SH can relieve inflammation of synovia and reduce the secretion of IL1 in synovial fluid and serumSo it can lighten the degeneration of the cartilage and alleviate the pathology of OA,but it can not prevent the process of OA Key words：Sodiumhyaluronate; Osteoarthritis; Synovitis; Interleukin 1; Matrix metalloproteinase1 骨关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年的最常见关节疾患之一，是导致人群功能残疾、造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一〔1〕。

细胞的纯化方法介绍(自然纯化和人工纯化)

细胞的纯化方法介绍（自然纯化和人工纯化）体外培养的细胞源于人或动物或胚胎组织，体内的细胞都是混杂生长，每一种组织都有血管和间叶组织，因此，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等，混杂的细胞会直接影响实验结果，而利用体外培养细胞进行实验研究时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。

细胞的纯化：细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化。

可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的选择采用。

一、自然纯化：自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。

但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。

此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。

仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。

二、人工纯化：人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。

主要有以下5种方法。

1、细胞因子依赖纯化法：是通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。

人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的环境才能长期存活和生长繁殖，如白细胞介素-2（IL-2）SHI 他细胞生长所必须的细胞因子，B细胞生长因子是B细胞的生长因子，体外培养中淋巴细胞若加入IL-2就可使T细胞生长繁殖，形成IL-2依赖的T细胞，如CTLL-2细胞系，而其他细胞则自然被淘汰，采用此法还建立了IL-6依赖的细胞系，如B9、CTD7细胞系。

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定作者：马民吕志刚杜以宽张桂娟马义【摘要】目的建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系。

方法运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs，利用相差显微镜观察其形态及生长情况，扫描电镜观察其细胞结构，运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力，用MTT比色法绘制细胞生长曲线，并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化，利用ALP和油红O进行染色鉴定。

结果所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征，分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期，第10天进入平台期；在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨、成脂肪表型特征，可进一步定向分化，结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性。

【关键词】骨髓间充质干细胞；分离；成骨分化；成脂分化【Abstract】 Objective To establish a sustained and stable bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) isolation and culture system which could be pluripotential in vitro. Methods BMSCs were isolated and cultured from the 1month old New Zealand white rabbits through density gradientcentrifugation. Growth and ultromicrostructure of the BMSCs were observed by light microscope and scan electron microscope. The cell activities and cell cycle were observed by flow cytometry. The grow curve of the BMSCs was described through MTT assay. BMSCs were induced and differentiate into osteoblasts and adipocytes by specific induction culture medium. Then the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) and Oil red O , and analyzed the result of all staining. Results The isolated BMSCs cells were in line with the characteristics of BMSCs in morphology and growth kinetics, and the isolated BMSCs cells would be into the logarithmic growth phase in the third day and into the platform phase in the tenth day. Conclusions In the osteogenic and adipogenic induced culture conditions, BMSCs have appeared the phenotypic characteristics of osteogenic and adipogenic respectively, and could be further directed differentiation. These indicated the harvested cells possessed BMSCs specificity.【Key words】 Bone marrow derived mesenchymal stem cells(BMSCs); Isolation; Osteogenic differentiation; Adipogenic differentiation软骨组织工程技术〔自体软骨细胞的移植、生长因子对软骨细胞的作用、骨髓间充质干细胞（又称骨髓基质干细胞，BMSCs）在软骨组织工程中的作用、转基因技术〕是当今的研究热点〔1，2〕。

兔血清纯化

兔血清抗体分离纯化抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响。

因此只能根据不同目的的要求，从抗血清中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。

抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。

粗提法主要常用硫酸铵盐析法，精制法分非特异性和特异性两种类型。

非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法，其方法均系基于蛋白质分子的物理性质。

特异性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗体的特异性反应。

一、盐析法(Salt fractionation)（粗提）【实验原理】当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对于水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质水分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子间聚集而沉淀。

不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分段从溶液中沉淀出来。

蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。

盐析法：硫酸铵分级沉淀【主要试剂与仪器】实验材料：兔血清（20 ml-200 ml）试剂：饱和硫酸铵溶液（用前以 5 mol/L NaOH调至pH7.4）、0.01 mol/L Ph7.4 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline PBS）、奈氏试剂实验器材：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双蒸水煮沸10 min）等仪器：搅拌器、离心机、电泳仪等【溶液配制】a、饱和硫酸铵溶液的配制：取500 ml蒸馏水加热至70～80 ℃，称(NH4)2SO4400～425 g溶于蒸馏水中，搅拌20 min，趁热过滤，冷却，配制好的饱和硫酸铵溶液，瓶底应有结晶析出，在使用前用28%的氨水调pH至7.4。

细胞免疫磁珠法综述

细胞免疫磁珠法综述1.摘要疫磁性珠（Immonumagnetic beads ,IMB）是免疫微球的一种。

免疫微球是于70年代中期发展起来的一项免疫学技术，它具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性，所以它在免疫检测、免疫吸附、细胞分离和培养等领域中得到越来越广泛的应用免疫磁珠分离法的原理是将抗特异细胞表面的抗体致敏到磁珠的上，形成免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)。

待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。

2.免疫磁珠法的分类通常有两种分离方式：阳性分离和阴性分离。

阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化。

前者涉及到磁珠与细胞的解离，简单的方法是37℃过夜即可，也可用商品化的分离系统进行抗原与抗体的解离，使解离的细胞既无抗体残留，又不改变其功能和活性。

磁性材料：γ-Fe2O4、Me-Fe2O4（Me = Co，Mn，Ni）、Fe3O4、Ni、Co、Fe、Fe-Co和Ni-Fe 合金等，目前被研究最多且应用最广泛的是铁及其氧化物（Fe、Fe2O4和Fe3O4等）。

高分子材料：聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、多糖(纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖等)和牛血清白蛋白等。

表面常带有化学功能的基团,如-OH、-NH2、-COOH和-CONO2等，使得磁性微载体就几乎可以偶联任何具有生物活性的蛋白。

功能配基：配基必须具有生物专一性的特点,而且载体和微球与配基结合后不影响或改变配基原有的生物学特性，保证微球的特殊识别功能。

磁性微球结构磁性微球由载体微球和配基结合而成。

理想的磁性微球为均匀的球形、具磁性物质3下面是我总结的一些关于磁珠法方面的一些应用1、用于细胞分离和提纯使用IMB进行分离细胞有两种方式；直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。

兔子解剖实验报告步骤

一、实验目的1. 通过对兔子的解剖，了解哺乳动物的内部结构，掌握哺乳动物各系统的组成和功能。

2. 学习解剖操作技巧，提高动手能力。

3. 培养观察、分析、记录和总结实验结果的能力。

二、实验原理本实验通过解剖活兔，观察其内部器官和系统的结构，了解哺乳动物的主要器官和系统的组成、位置和功能。

三、实验器材1. 活兔一只2. 解剖盘一个3. 注射器一支（10ml）4. 解剖剪一把5. 镊子一把6. 解剖针一把7. 火柴或打火机8. 水盆一个9. 麻醉剂（如氨基甲酸乙酯）10. 记录本和笔四、实验步骤1. 麻醉与处死兔- 将兔置于解剖盘内，用酒精棉球擦拭兔耳内侧，以消毒。

- 取注射器，抽取适量的麻醉剂（如氨基甲酸乙酯）。

- 用注射器将麻醉剂注入兔耳缘静脉内，直至兔子失去意识。

- 等兔子完全失去意识后，用解剖剪在兔耳后缘处剪断血管，使兔子迅速死亡。

2. 皮肤解剖- 湿润兔毛，用解剖剪沿兔体正中线剪开皮肤，至肛门处。

- 用解剖剪将皮肤和肌肉层分离，暴露肌肉层。

- 将皮肤和肌肉层向两侧翻开，暴露内脏器官。

3. 内脏器官观察- 观察并记录内脏器官的形态、位置和大小。

- 分别观察以下器官：a. 消化系统：胃、小肠、大肠、肝脏、胆囊、胰腺等。

b. 呼吸系统：气管、支气管、肺等。

c. 循环系统：心脏、血管等。

d. 泌尿系统：肾脏、输尿管、膀胱等。

e. 生殖系统：卵巢、睾丸、子宫、阴道等。

4. 器官解剖- 分别对各个器官进行解剖，观察其内部结构。

a. 消化系统：观察胃的形态、胃壁的构造、小肠和大肠的排列等。

b. 呼吸系统：观察气管和支气管的分支、肺的叶间裂等。

c. 循环系统：观察心脏的四个腔室、血管的分布等。

d. 泌尿系统：观察肾脏的形态、肾单位的结构等。

e. 生殖系统：观察卵巢和睾丸的形态、生殖器官的排列等。

5. 器官采集与保存- 将解剖后的器官采集起来，分别进行编号和保存。

- 可将器官浸泡在福尔马林溶液中，以便长期保存。

兔类风湿性关节炎模型的建立及成纤维样滑膜细胞的培养

兔类风湿性关节炎模型的建立及成纤维样滑膜细胞的培养文永兵;郭艳幸;张玉可【摘要】目的:建立卵蛋白诱导的兔类风湿性关节炎模型,明确兔类风湿性滑膜细胞培养的条件,储备后期用于实验研究的滑膜细胞,为后期体外细胞实验提供最佳实验条件.方法:健康大耳白兔8只,随机分为正常组4只,模型组4只,模型组建立卵蛋白诱导的类风湿性关节炎动物模型,动物模型建成后第2周取模型组兔膝关节滑膜细胞培养、传代、收集冻存细胞,1月后复苏细胞.结果:模型组兔膝关节病理切片见炎性细胞浸润,滑膜细胞增生明显,血管翳形成,并侵蚀和破坏软骨;培养的滑膜细胞具有成纤维细胞的形态和特征,呈长梭形极向生长,成功储备及复苏滑膜细胞.结论:成功建立兔类风湿性关节炎模型,成功地培养出了兔膝关节类风湿性滑膜细胞.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2014(023)004【总页数】3页(P21-22,24)【关键词】类风湿性关节炎;滑膜细胞;细胞培养【作者】文永兵;郭艳幸;张玉可【作者单位】安徽中医药大学,安徽合肥 23003;洛阳正骨医院,河南洛阳 471000;河南中医学院,河南郑州 450000【正文语种】中文【中图分类】R593.22类风湿性关节炎 (Rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性炎症性自身免疫功能障碍性疾病，主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎，基本病理特征为关节滑膜炎。

关节滑膜炎症细胞浸润，滑膜细胞增殖，血管翳形成并侵袭关节软骨和骨组织，造成关节结构的破坏［1］。

其确切病因及发病机制尚未完全明确，目前尚无有效的治疗方法。

近年来研究表明，类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞 (fibroblast-like synovio—cytes，FLS)增生活跃，具有转化细胞的特征，能够形成肿瘤样病灶，可能是类风湿关节炎疾病发生的早期特征［2］。

制备兔类风湿性关节炎模型，为研究RA的发病机制提供了一个良好的平台;体外培养FLS为临床药物的开发与评估提供了一个理想的实验条件，对进一步揭示RA的发病机制及开发防治RA的药物具有深远的意义。

实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化课件

抗体结构
抗体分子是由两条轻链(light chain, L链)和两条重链 (heavy cቤተ መጻሕፍቲ ባይዱain, H链) 通过链间二硫键连接而成。
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
二、实验原理一盐析
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，这个过程叫做盐析。
• 应用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理盐水作10倍稀释，加入NaCl至终浓度为0.85%，即为PBS。
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
柰氏试剂
• HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml；搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为20%的溶液NaOH 50ml。
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
实验原理-盐析
• 不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。
• 蛋白质盐析中最常用的盐是硫酸铵 • 硫酸铵分级沉淀
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
三、实验仪器及试剂
1. 实验材料：血清（兔免疫血清）。 2. 试剂：0.01mol/LpH7.4 PBS、0.5 mol/L NaOH、
无黄色。
实验一兔血清免疫球蛋白分离与纯化
五、数据处理及计算
蛋白质及其定量鉴定：取样品少许作适量稀释，以紫外分光光度计测量蛋白含量 260、280nm处读数蛋白含量（mg /mL）＝

细胞分离与培养技术

流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。
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细胞分离技术
二、从原代组织中分离细胞组织和器官采集：
人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹
过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
优缺点：
流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞
因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与T淋巴细胞分离。
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具体步骤：
单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3） ×107/ml的细胞悬液。
先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。
3.中性蛋白酶(Dispase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次
加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
在37℃孵育20分钟到几个小时。
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细胞分离技术
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase