ALK基因断裂检测试剂盒(荧光原位杂交法)
FISH检测在血液肿瘤中的应用-临床宣讲
111 32 79
114
133
Dö hner H, Engl J Med. 2000;43:1910-1916.
▶ 慢性粒细胞白血病（CML）
慢性粒细胞白血病（CML）检测BCR/ABL融合基因、ASS基因。
推荐样本：骨髓
适用人群： CML初诊及治疗监测的患者
BCR/ABL融合基因检测试剂盒
•探针：GLP BCR/GLP ABL
AML1/ETO融合基因：竞争性抑制AML1靶基因的活化，干扰细胞正常的增殖与 分化。
AML1/ETO基因检测意义
辅助诊断M2型AML
AML1/ETO融合基因可见于92%的M2型AML患者中，特别 是和我国首先提出的M2b型密切相关。 判断预后 AML1/ETO融合基因阳性是预后好的标志，患者对治 疗反应佳，完全缓解率可达90%，5年无病生存可达50%70%。
急性早幼粒细胞白血病（M3）检测PML/RARA融合基因。
推荐样本：骨髓
适用人群： 临床可疑M3的患者
PML/RARA融合基因检测试剂盒
探针：GLP PML/GLP RARA PML基因（promyelocytic leukaemia，PML） ：早幼粒细胞白血病基因, 位于15号染色体上。
RARA基因(retinoic acid receptor- ，RARA ) ：维甲酸受体基因，位于 17号染色体上。
首款肺癌全自动免疫组化伴随诊断试剂盒在华获批上市
首款肺癌全自动免疫组化伴随诊断试剂盒在华获批上市
有效识别ALK蛋白表达实现肺癌患者个体化治疗
肺癌是全球排名第一位的肿瘤杀手。与30年前相比，我国肺癌死亡率上升了465%[1]，发病率高居榜首。肺癌通常分为非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。其中NSCLC占了肺癌的85%。
随着肿瘤分子生物学的进展，临床上对NSCLC的认识正不断深入。研究表明，50% NSCLC的发生是由于一系列的驱动基因，包括EGFR，KRAS，ALK，MEK，PI3K，BRAF等。找到驱动基因，再进行针对性用药，NSCLC治疗就能事半功倍。研究人员发现，胰岛素受体家族的成员——间变性淋巴瘤激酶（ALK）是NSCLC的关键启动癌基因。在NSCLC患者中，虽然只有5%[2] [3] [4]的患者会出现ALK基因重排，但是中国每年新发病例数仍接近35,000例[5]。由于ALK阳性NSCLC具有明确的分子靶点、靶点检测技术以及上市的靶向药物，通过准确诊断ALK基因重排， ALK阳性患者可从酪氨酸激酶抑制剂（克唑替尼）治疗中获益，明显提高临床疗效。
从组织学分型上，还有肺腺癌和肺鳞癌之分。由美国病理协会、国际肺癌研究协会、分子病理协会出台的《肺癌分子标志物检测指南2013》明确指出：所有含有腺癌成分的NSCLC均需检测ALK。今年6月，由中国临床肿瘤学会肿瘤生物标志物专家委员会出台的《中国间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013版）》（简称《共识》）指出：对于潜在怀疑存在ALK基因融合变异的患者均可进行ALK融合基因检测。
克唑替尼胶囊Crizotinib-详细说明书与重点
克唑替尼胶囊Crizotinib
英文名称: Crizotinib Capsules
【成分】
本品主要成份为克唑替尼，其化学名称为：(R)-3-[1-(2,6-二氯-3-氟-苯)-乙氧基]-5-(1-哌啶-4-烃基-1 氢-吡唑-4-烃基)-嘧啶-2-茚满，化学结构式：
辅料名称：二氧化硅、微晶纤维素、无水磷酸氢钙、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁。
【性状】
本品为胶囊剂，内容物为白色至淡黄色粉末。
【适应症】
克唑替尼胶囊可用于间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗。
克唑替尼胶囊可用于ROS1 阳性的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗。
【规格】
(1) 250 mg；(2) 200 mg
【用法用量】
患者选择：本品必须在有使用经验的医疗机构中并在特定的专业技术人员指导下使用。服用本品前，必
须获得经充分验证的检测方法证实的ALK阳性或ROS1阳性评估结果。
推荐剂量：克唑替尼胶囊的推荐剂量为250mg 口服，每日两次，直至疾病进展或患者无法耐受。对于无需透析的严重肾损害（肌酐清除率[CLcr]<30ml/分钟）患者，克唑替尼胶囊的推荐剂量为250 mg 口服，每日一次。胶囊应整粒吞服。克唑替尼胶囊与食物同服或不同服均可。若漏服一剂克唑替尼胶囊，则补服漏服剂量的药物，除非距下次服药时间短于6 小时。如果在服药后呕吐，则在正常时间服用下一剂药物。
剂量调整：果患者出现美国国立癌症研究所不良事件通用术语标准（NCI CTCAE，第4.0 版）规定的严重程度为3 级或4 级的不良事件，需一次或多次减少剂量，按以下方法减少剂量：·第一次减少剂量：口服，200 mg，每日两次
基因断裂探针(荧光原位杂交法)免疫组化
基因断裂探针(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种分子生物学技术，用于检测染色体或基因组中的特定序列。它利用荧光标记的DNA或RNA探针与目标序列杂交，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的位置和强度，从而确定目标序列的存在和位置。
免疫组化(immunohistochemistry，IHC)是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。它利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过染色或荧光标记来显示目标蛋白质的存在和位置。
基因断裂探针和免疫组化是两种不同的技术，它们在应用场景和原理上有所不同。基因断裂探针主要用于检测染色体或基因组中的特定序列，而免疫组化主要用于检测组织或细胞中特定蛋白质的存在和位置。
肺腺癌中ALK基因重排的检测
ｌｅｖｉａｔｅｓｃｅｃａｌｌｉｇａｔｉｏｎａｎｄｐｕｎｃｔｕｒｅ（ＣＬＰ） ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｐ ｔｉｃｓｈｏｃｋ
［Ｊ］．Ｓｈｏｃｋ，２０１６，４６（２）：１８３ １９３．［２９］ＡｈｍａｄＡ，Ｇｅｒ Ｄ，ＯｌａｈＧ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ
ｉｎｍｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ γ ｌｙａｓｅ，ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ β ｓｙｎｔｈａｓｅｏｒ３ ｍｅｒｃａｐｔｏｐｙｒｕｖａｔｅｓｕｌ ｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｊ］．ＩｎｔＪＭｏｌＭｅｄ，２０１６，３８（６）：１６８３ １６９２．
［３０］ＧａｄｄａｍＲＲ，ＦｒａｓｅｒＲ，ＢａｄｉｅｉＡ，ｅｔａｌ．Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ
ｇａｍｍａ ｌｙａｓｅｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｐｒｏｔｅｃｔｓｍｉｃｅａｇａｉｎｓｔｉｎｆｌａｍ ｍａｔｉｏｎａｎｄｌｉｖｅｒｓｉｅｖｅｉｎｊｕｒｙｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｅｐ ｓｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１６，１１（８）：ｅ０１６０５２１．
［３１］ＡｎｇＳＦ，ＳｉｏＳＷ，ＭｏｏｃｈｈａｌａＳＭ，ｅｔａｌ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌ
ｆｉｄｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２ａｎｄｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｉｎｓｅｐｓｉｓ ｅｖｏｋｅｄａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙｖｉａｔｒａｎｓｉ ｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｖａｎｉｌｌｏｉｄｔｙｐｅ１ｃｈａｎｎｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２０１１，１８７（９）：４７７８ ４７８７．
基因突变检测方法
基因突变检测方法
基因突变检测主要有三种检测方法，即FISH检测、Ventana-D5F3 IHC检测和NGS检测。基因突变检测方法的特点主要体现在以下几方面：
1、FISH：也称为荧光原位杂交技术，其检测的特异性和敏感性都比较高，也是ALK融合基因检测的金标准，因为FISH检测的技术要求比较高，所以也存在有自身问题，如在检测过程中，如果标本固定时间较长、烤片温度较高、变异性温度差异、蛋白消化不当等，就会引起荧光信号的减弱，或者没有信号，容易出现基因突变的假阴性或假阳性；
2、IHC：是一种免疫组化的检测方法，此方法操作比较简单、检测比较快速、经济成本较低，灵敏度较高。因为对标本需求量较低、IHC检测高灵敏度、高特异性等优点，ALK检测共识中已经推荐优先应用；
3、NGS：也称为二代测序、高通量测序技术，这项检测在ALK基因检测中的地位越来越高，NGS检测能区分ALK突变的所有亚型以及ALK基因本身可能存在的点突变，在临床上可以指导医生后续用药，但是检测费用较贵，临床上主要推荐用于ALK靶向药物耐药的患者检测。
alk突变机理
alk突变机理
ALK突变机理
引言
ALK（anaplastic lymphoma kinase）是一种酪氨酸激酶受体，它在细胞内发挥重要的信号传导作用。ALK突变是一种常见的肿瘤相关基因突变，与多种肿瘤的发生和发展密切相关。本文将重点介绍ALK突变的机理及其在肿瘤中的作用。
1. ALK基因突变的类型
ALK基因突变包括多种类型，如点突变、缺失突变、插入突变等。最常见的ALK突变类型是基因融合，即ALK基因与其他基因的融合产生新的融合基因，如EML4-ALK、NPM-ALK等。这些融合基因的产生往往导致ALK信号通路的异常激活，从而促进肿瘤的发生和发展。
2. ALK突变的机制
ALK突变的机制主要包括基因重排、点突变和基因扩增等。基因重排是指ALK基因与其他基因的染色体断裂并重新连接，从而产生新的融合基因。点突变是指ALK基因中某个碱基发生突变，导致蛋白质结构或功能的改变。基因扩增是指ALK基因在染色体上的复制增加，使其表达水平升高。
3. ALK突变的影响
ALK突变的主要影响是异常激活ALK信号通路，进而促进肿瘤细胞
的生长、增殖和转移。正常情况下，ALK信号通路的激活是有限的，但在ALK突变的情况下，ALK融合蛋白或突变蛋白可以持续激活ALK 信号通路，从而导致细胞的异常增殖。此外，ALK突变还可以影响细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭等生物学行为，进一步促进肿瘤的发展。
4. ALK突变与肿瘤的关系
ALK突变在多种肿瘤中都有发现，包括肺癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤等。其中，ALK融合基因在非小细胞肺癌中最为常见，与肺癌的发生和预后密切相关。研究表明，ALK融合基因在肺癌中的发生率约为3-7%，其阳性患者对ALK抑制剂的治疗反应良好。此外，ALK 突变在其他肿瘤中也被广泛研究，为肿瘤的分子诊断和治疗提供了新的靶点。
alk突变金标准
ALK突变是一种在某些类型的肺癌中常见的基因异常，它为疾病治疗和预后提供了重要的信息。对于ALK突变，存在多种检测方法，但哪种方法是金标准呢？
首先，要明确金标准的意义。在医学界，金标准是指被广泛接受并能准确地诊断某种疾病的试验或测试。对于ALK突变来说，理想的金标准应该具有高敏感性、高特异性、易于解读等特点。
目前，检测ALK突变最常用的方法是荧光原位杂交法（FISH）和ALK基因重排检测试剂盒。FISH是一种被广泛接受的检测方法，具有高特异性，但敏感性相对较低。而ALK基因重排检测试剂盒则具有较高的敏感性和特异性，且易于解读。
综合考虑，虽然FISH在某些情况下也被视为ALK突变的金标准，但随着技术的进步和研究的深入，ALK基因重排检测试剂盒因其高敏感性和特异性，以及易于解读等优点，正逐渐被越来越多的医生和研究人员视为检测ALK突变的金标准。
值得注意的是，无论采用哪种方法，对于ALK突变的结果解读都需要专业的医学知识和经验。因此，在进行ALK突变检测时，应选择具有相关资质和经验的医疗机构和医生进行诊断。
综上所述，虽然FISH在ALK突变检测中仍然具有一定的地位，但ALK基因重排检测试剂盒因其高敏感性和特异性，以及易于解读等优点，正逐渐成为ALK 突变检测的金标准。选择合适的检测方法，并由具有相关资质和经验的医疗机构和医生进行诊断，将有助于更准确地诊断疾病并提供合适的治疗方案。
FISH和RT-PCR法在ALK基因检测中的临床应用分析
FISH和RT-PCR法在ALK基因检测中的临床应用分析李霄;刘冲;李扬;朱芸;宋国新;张智弘
【摘要】目的：探讨荧光原位杂交( fluorescence in situ hybrid-ization, FISH)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应( real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reac-tion, RT-PCR)技术检测非小细胞肺癌中间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)突变的差异性。方法应用FISH及RT-PCR技术分别检测22例非小细胞肺癌中ALK基因突变,采用Spearman Correlation统计法进行差异性比较分析。结果两种方法在检测非小细胞肺癌中ALK基因突变的结果具有一致性( P<0.05)。结论虽然两种方法检测ALK 基因突变结果具有一致性,但实际操作中RT-PCR法比FISH法更简便、敏感、易判读。
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2014(000)009
【总页数】3页(P1045-1047)
【关键词】肺肿瘤;非小细胞肺癌;ALK基因;RT-PCR;FISH
【作者】李霄;刘冲;李扬;朱芸;宋国新;张智弘
【作者单位】南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029;南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029;南京医科大学第一附属医院病理科，南京210029;南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029;南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029;南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029
免疫组化检测非小细胞肺癌ALK融合基因表达异常
免疫组化检测非小细胞肺癌ALK融合基因表达异常
侯丹阳;邵璐;徐傲;冷再君;伍权;李传应;陈柯;徐修才;操乐杰
【摘要】Purpose To explore the accuracy of ALK fused gene expression by immunohistochemistry ( IHC) in non-small cell lung cancer ( NSCLC) patients, and to investigate the clinical and pathological features of ALK-positive NSCLC patients. Methods By u-sing rabbit monoclonal D5F3 antibody, ALK IHC was performed on 234 NSCLC patients. ALK positive cases were confirmed by reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) . Results The positive incidence of ALK by IHC in 234 NSCLC specimens was 8. 97% (21/234), the positive rate of ALK fused gene verificated by RT-PCR was 5. 98% (14/234). There was significant difference with histological type, age, stage (P<0. 05), but no significant difference with gender, smoking history, tumor differentiation. Of 21 cases of ALK-positive NSCLC patients, the consistency of IHC and RT-PCR was 0 when IHC was ( +) , however, when IHC was or immunohistochemical score
北肿发补方案最终版
北肿发补方案最终版-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
方案编号：NHCIP001-3
发补临床试验方案
产品名称：人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）
包装规格：48测试/盒
临床试验类型：
■发补临床试验
方案版本号和日期：
承担临床试验的医疗机构（签章）：北京肿瘤医院
主要研究者姓名（签字）：
联系电话：
统计学负责人（签名）：
统计学负责单位（盖章）：北京大学第一医院医学统计室
注册申请人（盖章）：天津诺禾致源生物信息科技有限公司
注册申请人联系人：张双华
联系电话：/0
一、实验目的
根据《人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）》注册审评的发补要求：
1）补充待考核试剂盒与已上市荧光PCR试剂盒在检验临床样本时的一致性研究，检验基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1。
2）补充待考核试剂盒与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂作为对比试剂的比对研究临床试验，检验基因（突变）包括EGFR（19del、L858R）、ALK、ROS1。
二、待考核试剂盒和对比试剂盒的检测原理、方法：
待考核试剂盒基于半导体测序法，针对与非小细胞肺癌靶向治疗密切相关的基因（包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK和ROS1）的多个位点的特异靶序列进行多重PCR扩增，构建文库，混样后进行半导体测序。待考核试剂盒基于半导体测序法，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，测序时依次加入A/C/G/T碱基，DNA聚合酶以固定的单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链，并释放氢离子，所释放出的H离子在穿过孔底部时能被检测到，然后通过对所释放H离子的检测，实时判读碱基。如果DNA 链含有连续碱基，则记录的电压信号加倍。如果碱基不匹配，则无氢离子释放，也就没有电压信号的变化。这种方法属于直接检测DNA的合成，因少了CCD扫描，荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。运行结束后，利用生物信息学方法将测得序列与参考序列比对，通过数据分析判断靶序列是否发生突变或融合。
浅述ALK融合突变及其检测方法（上）
浅述ALK融合突变及其检测方法（上）
作者：闵
ALK融合突变是非小细胞肺癌常见驱动基因突变之一，因其靶向药使用时间长，平均生存期长，也被病友们戏称为“钻石突变”。由于ALK融合突变发生概率仅5%-7%左右，不少病友都很羡慕ALK阳性的幸运儿，也希望同样的运气降落在自己身上，于是如何认识ALK 融合突变、如何检测ALK突变以及如何看懂结果就成了需要回答的问题。
有很多病友会奇怪自己的基因检测报告上有ALK突变却被告知不能吃靶向药，或者为什么自己的病理报告上写着ALK（+）还要做基因检测？想回答这些问题，我们需要去了解什么是ALK融合突变，究竟是怎么检测的。
什么是ALK融合突变？
让我们先了解一下主角ALK融合突变到底是怎么回事。ALK基因全称为间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK），总共有29个外显子。
为了方便理解，各位可以将它想象成一辆名为ALK的高铁列车，而29个外显子就是列车的29节车厢，那么“融合突变”就是指ALK 的某节车厢断裂并且与其他班次的列车车厢相接变成一个新的列车，最常见的是从ALK号列车的20号车厢处断裂，并与另一辆名为
“EML4”的基因重新拼接，如下所示。
已发现的所有ALK基因融合突变都是在ALK基因外显子20处发生断裂，而EML4断裂点有外显子2/6/13/14/15/17/18/20，即上图中与断裂后的ALK基因20号外显子重新连接的不但可以是EML4基因13号外显子，也可以是其他外显子。
上面例子可简称为“E13:A20”，即代表EML4外显子13与ALK 外显子20融合，有些基因检测报告的结果也采用这种缩写。不同的融合类型使用靶向药的效果也不同，这是后话在此不过多赘述。
alk检查方法
alk检查方法
ALK是一种基因，其在某些类型的癌症中发挥着重要作用。为了检测癌症患者是否携带ALK基因变异，可以采用以下几种方法进行检测：
1. 荧光原位杂交（FISH）：这是一种基于DNA的检测方法，通过特定的探针来检测细胞中是否存在ALK基因的融合或扩增。如果细胞中存在ALK基因的融合或扩增，则FISH试验会呈现阳性结果。
2. 免疫组织化学（IHC）：这是一种基于蛋白质的检测方法，通过特定的抗体来检测细胞中是否存在ALK蛋白的表达。如果细胞中存在ALK蛋白的表达，则IHC试验会呈现阳性结果。
3. 聚合酶链式反应（PCR）：这是一种基于DNA的检测方法，通过特定的引物来扩增细胞中ALK基因的特定片段。然后对扩增的片段进行测序，以确定是否存在ALK基因的变异。
4. 下一代测序（NGS）：这是一种高通量的检测方法，可以对癌症患者的基因组进行全面扫描，以检测是否存在ALK基因的变异。
需要注意的是，不同的检测方法可能适用于不同的临床情境和目的。因此，在选择ALK检测方法时，应根据具体情况进行选择。
EML4—ALK融合基因检测在实际工作中应用的体会
EML4—ALK融合基因检测在实际工作中应用的体会
隨着靶向药物与个体化治疗的发展与广泛应用，肿瘤治疗已经进入到分子靶向治疗的时代。现代分子诊断技术的靶点检测是分子靶向治疗的前提，EML4-ALK融合基因发现主要表达于非小细胞肺腺癌中，利用高灵敏度和特异性的检测系统，将有助于筛选EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌患者。
标签：EML4-ALK 融合基因非小细胞肺癌靶向治疗
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%.EML4-ALK融合基因被发现存在于部分非小细胞肺癌中。该融合基因常见于不吸烟的肺腺癌患者，有其独特的病理学特征，可以诱导肿瘤生成。ALK抑制剂能够作用于该基因的下游信号传导通路并拮抗其促肿瘤生成活性。近年来靶向治疗药物对特定基因型的非小细胞肺癌患者有明显的治疗作用，因此，有效的筛选出EML4-ALK融合基因阳性NSCLC是指导患者治疗的关键。
目前，利用患者的组织标本检测EML4-ALK融合基因的方法，常用的有荧光原位杂交技术（FISH），RT-PCR技术，免疫组化（IHC）及cDNA末端快速扩增技术均可检测EML4-ALK融合基因，哪种检测方法更快捷、灵敏度和特异性更高成为了大家面临的新问题。现对我院开展的常用EML4-ALK融合基因检测方法进行比较如下：
1. RT-PCR检测：在非小细胞肺癌的病例中，多种EMLA-ALK融合基因的突变体己经被发现，多数是由于EML4基因的断裂点不同导致，因此精确诊断EML4-ALK阳性肿瘤需要检测EML4基因和ALK基因cDNA的所有融合方式，现已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体，在目前已知EML4-ALK融合转录突变体的基础上，采用三条引物组成的多重RT-PCR技术检测目前已知的多种突变体。且由于EML4-ALK为倒位融合，野生型组织细胞采用该RT-PCR不会产生扩增条带。该方法基于PCR技术，敏感且特异性好，粗略明确EMLA-ALK融合突变体。但也存在一些不足，对于潜在的非EML4基因与EML4-ALK融合则不能被检测到，而且对于潜在的EML的第21个外显子与ALK融合的转录突变体长度达1284bp，可能难于检测到。而且在实际工作中，对于一些肺部穿刺的活检标本因为量太少而无法检测。
alk融合突变类型
alk融合突变类型
摘要：
1.概述ALK 融合突变类型
2.ALK 融合突变类型的分类
3.ALK 融合突变类型的临床意义
4.ALK 融合突变类型的检测方法
5.总结
正文：
1.概述ALK 融合突变类型
ALK 融合突变类型是指在肿瘤发生过程中，ALK 基因与其他基因发生融合，形成新的基因。这种突变类型在非小细胞肺癌（NSCLC）等多种肿瘤中均有发现，与肿瘤的发生、发展及治疗有着密切关系。
2.ALK 融合突变类型的分类
根据融合伙伴的不同，ALK 融合突变类型可分为以下几类：
（1）ALK-EML41：这是最常见的ALK 融合类型，约占所有ALK 融合的70%。EML41 是一种基因，与ALK 发生融合后，可导致ALK 信号通路的激活，从而促进肿瘤生长。
（2）ALK-Fus1：这是一种较少见的ALK 融合类型，约占10%。Fus1 是一种核糖体蛋白，与ALK 融合后同样可以激活ALK 信号通路。
（3）ALK-TMP46：这也是一种较为罕见的ALK 融合类型，与ALK-EML41 和ALK-Fus1 类似，可激活ALK 信号通路。
（4）其他类型：除上述三种常见的ALK 融合类型外，还有一些罕见的类型，如ALK-AT1、ALK-SQSTM1 等。
3.ALK 融合突变类型的临床意义
ALK 融合突变类型对于肿瘤的诊断、治疗和预后具有重要的临床意义。首先，ALK 融合突变类型可作为NSCLC 等肿瘤的诊断标志物，有助于早期发现、早期诊断。其次，针对ALK 融合突变类型，目前已有多款针对性的靶向药物上市，如克唑替尼、色瑞替尼等，这些药物具有较好的疗效和安全性。最后，ALK 融合突变类型的存在还可影响患者的预后，有研究发现，ALK 融合突变型NSCLC 患者的生存期较其他类型患者更长。
alk融合种类 -回复
alk融合种类-回复
ALK融合种类是指一种融合基因，由突变原癌基因ALK与其他基因融合而成。这种融合事件常见于肿瘤细胞中，尤其是肺癌和神经母细胞瘤等恶性肿瘤中。通过分析ALK融合的种类，可以为研究人员和医生提供更多关于肿瘤的信息，从而指导治疗和预后评估。
目前已经发现了多种不同类型的ALK融合，下面将一步一步介绍这些融合种类。
第一步：ALK融合的初步发现
ALK融合最早是在非小细胞肺癌（NSCLC）中被发现的。2007年，研究人员发现ALK融合与NSCLC的发生有重要关联。这一发现促使科学家们开始深入研究ALK融合的种类和功能。
第二步：EML4-ALK融合
最常见的ALK融合类型是EML4-ALK，即艾克曼(Echinoderm microtubule-associated protein-like 4)与ALK融合。EML4-ALK融合最早在2007年被描述，在NSCLC中占据了主导地位。这种融合区域通常包括EML4的N端Coiled-coil结构域和ALK的激酶结构域。
第三步：其他ALK融合类型
除了EML4-ALK，还发现了其他一些ALK融合变体，包括TPM3-ALK、NPM-ALK、TFG-ALK等。这些融合类型在不同的肿瘤类型和个体中都有发现，但相对较少见。
第四步：ALK融合的检测方法
为了检测ALK融合和种类，科学家们开发了多种实验方法。其中最常
用的方法是荧光原位杂交（FISH）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。FISH 可以检测ALK基因重排和融合事件是否发生，而RT-PCR则可以确定具体融合的种类。
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样板 1：典型信号模式
指南 A.分开的橙色或绿色信号视为一个信号。
B.模糊的或者是细长的 DNA 纤维视为一个信号（无论红色或是绿 色）。
C.两个相邻的橙色和绿色信号距离小于两个信号直径或者重叠，应 视为一个融合信号。
D. 如果扩散的信号临近或者相连，应视为一个融合信号。
E.两个相邻的信号距离小于两个信号直径，且大小和颜色均相同， 应视为一个信号（也就是一个信号分裂的情况）。
染
溶液中各1分钟进行梯度脱水后再复染。
过
弱
复染液陈旧或过度光照
确保复染液-20±3℃避光保存；
确保复染液未失效。
Βιβλιοθήκη Baidu
信号特征 2：阳性
2：断裂分离或缺失绿色信号
2A.
2B. 这些细胞核包括重组或分离的信号，分开的距离超出两
个信号直径大小。
A．细胞核具有一种以上分离信号。
B．细胞核有融合的和分离的信号。
杂交后，在荧光显微镜下下可以观察到在 ALK 基因未发生断裂时，显示为红绿融合的 黄色信号。反之，ALK 基因发生断裂时，红色和绿色信号分开且距离大于两个信号直径的大 小，或者是一个单独的红色信号 2-6 。
本试剂盒包含 ALK 探针混合物和复染液 DAPI。
【主要组成成分】
试剂 ALK 探针
规格 10 人份 20 人份
图 2：ALK 信号计数指南
信号特征 1：阴性
1. 相邻的或融合的 红色和绿色信号
1A.
1B. A.和 B.这些样本包含融合的红色或绿色信号。这些信
号为重叠的或为相邻的，或分开的距离不足两个信号直
径大小。
C.除了融合和/或断裂分离信号之外，还单独存在一个
绿色信号却不伴有相应的红色信号，这表示 ALK 探针
1C.
红色部分消失，视为阴性。药物作用的目标区域位于橙
色探针结合区域。
不计数只包括一种颜色荧光信号的细胞核。
问 可能的原因
题
推荐的解决方案
标本及探针变性不充分
确保玻片进行变性时温度在83±2℃； 将玻片变性时间延长2-4分钟。
玻片干燥不充分
探针滴加至玻片前，确保玻片上的乙醇溶液已经完全挥发。
杂交时盖玻片下有气泡 放盖玻片时要覆盖探针表面，轻轻挤压以便挤出气泡。
一、样本收集及玻片制备： 1、样本于常温下在10%中性福尔马林缓冲液中固定6~48小时，为了达到最佳 的和均匀的固定与石蜡包埋效果，样本大小不宜超过0.5cm3。 2、标准操作和石蜡包埋，使用高质量的石蜡。渗透和包埋应在低于65℃下进 行。 3、切成3μm厚的切片。 4、切片捞于有氢化硅涂层玻片或黏性玻片并在50~60℃环境中固定2~16 小时。 二、玻片预处理程序： 1. 56-65℃左右烤片过夜（至少 3 小时以上）。 2. 提前预热胃蛋白酶处理液（2mg/ml，10mM HCl），使其温度达到 37℃保温 备用。 3. 二甲苯中室温放置切片 10 分钟，重复该步骤两次。 4. 100%乙醇中室温放置切片 5 分钟，重复该步骤一次。 5.依次 85%、70%乙醇中室温放置切片 3 分钟。 6.去离子水洗涤三次。 7.用微波炉将适量的预处理缓冲液煮沸后，然后使其处于保温状态，放入切片 修复 20mins，或是在高压锅内加入适量的预处理缓冲液，高压修复 5min。 8. 取出玻片，用去离子水洗涤三次。将切片直接放入胃蛋白酶消化液中，消化 15±10mins。 注：根据不同的多种因素，如片子固定的条件与过程，片子厚度，组织/细胞的 特性，消化时间可以不同，我们建议：对于组织切片样本消化 5-25 分钟，对 于细胞样本消化 3-8 分钟。一般来讲，我们建议预实验找到样本的最佳消化时 间。且每次消化不超过 4 张切片。 9. 去离子水清洗 2mins，两次。 10. 脱水：70%，85%，100%乙醇溶液中依次放置 2 分钟，空气干燥切片。
三．FISH 操作步骤 警告和预防
荧光基团遇强光会产生光漂白现象。将含有荧光基团的试剂与玻片置于暗 处有助于减少此效应。所有不需光照的步骤（例如：孵育、洗涤等）均在暗处 进行。 （一）标本变性与杂交 1. 将含有的ALK探针的杂交液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器吸10μl至各个 样本。均匀滴加探针到整个目标区域；或者加探针到盖玻片中央，再将目标区 域反扣到盖玻片上。 2. 样本盖上盖玻片(20 mm×20 mm)，避免气泡；封片胶封片。 3. 将玻片放入杂交仪中反应，83℃（±2℃）变性 6 分钟，40℃过夜杂交。 注意：杂交期间片子绝对不能干！ （二）杂交后的处理 1、小心除去封片胶。 2、将切片置于0.1%NP-40/2×SSC溶液中，孵育10min，除去盖玻片。 3、将切片置于0.3%NP-40/2×SSC洗液（提前30min水浴加热到73±1℃）中，上
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第 2 组）。 除了融合和/或分离的信号之外，单独存在一个橙色荧光信号，不伴有相应
的绿色荧光信号（图 2，第 2 组）。
图 1：ALK 信号计数指南
红色信号 绿色信号 相邻或弥散的红绿信号
样本是无效的。
【检测方法的局限性】 本试剂盒采用荧光原位杂交技术用于非小细胞肺癌ALK基因重排检测，不能用于其他
正确
存（一般不超过两星期）；
将杂交后玻片置于-20℃避光保存。
观察时所选用的滤片组 不合适
使用正确滤片组观察探针荧光情况。 详情请咨询河南赛诺特生物技术有限公司技术服务部门。
显微镜构造及物镜不适 宜观察FISH标本，或者 滤片组损伤
请联系显微镜制造商。
标本制作前玻片清洗不
将玻片浸入无水乙醇中，滴片前用无绒纸巾擦干。
100μl
200μl
主要成分 荧光标记探针、甲酰胺、SSC、硫酸葡聚糖
DAPI
0.5ml
0.5ml
DAPI/抗褪色液、甘油
【储存条件及有效期】
ALK 基因断裂检测试剂盒于-20±3℃密封避光储存； 自生产之日起有效期为一年。
【适用仪器】
本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交，如 ThermoBrite 等。 本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果。所需荧光显微镜的配置包括： 物镜：在 FISH 分析上，使用 100×消色差浸油类型物镜可取得满意效果。 镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在荧光显微镜上 使用。 滤光片：建议顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便 选择与标记荧光染料相适应的滤片组。 绿色荧光：激发波长为 496nm，发射波长为 520nm，与 FITC 类似 橘红色荧光：激发波长为 551nm，发射波长为 572nm，与 Rhodamine 类似
基因突变方式的检测。 【注意事项】 1、供体外检测使用。 2、本试剂盒实验操作过程中，需戴乳胶手套操作，避免试剂接触肌肤。如不慎接触，立即
用大量水冲洗。 3、实验过程中的废弃样本及实验废弃物，需作为医疗废物统一回收处理 4、为得到理想的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。 5、实验过程中的常见问题及处理方法(见下表)：
本检测必须经医生批准方可检测使用，用以帮助判断患者是否适合接受非小细胞肺癌 (NSCLC)的相关药物治疗1,4。
【检验原理】
荧光原位杂交法（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）能够使细胞中特定的核苷酸 片段通过荧光而清楚的呈现，FISH 试验过程中包含了双链 DNA 的解链，荧光标记的 DNA 探针能够与目标序列结合[2-3]。杂交完成之后，多余的探针被清洗掉，同时，细胞核被复染剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色的荧光。
下提拉切片1-3s，放置2mins。 4、室温条件下，将切片置于0.1%NP-40/2×SSC洗液中，上下提拉1-3s，处理切 片3mins。 5、在70%、85%的乙醇溶液中依次处理切片2mins。 6. 避光晾干样本。 注：洗液缸中每次最好同时处理4张切片，当最后一张玻片放入考普林缸时开 始计时。 （三）观察 1. 滴加10 μl DAPI复染液到切片组织上，盖上盖玻片，避免气泡，暗处-20℃孵 育30分钟。 3. 荧光显微镜下观察。 （四）储存 完成杂交的玻片置于-20℃避光储存。 【结果阳性判断及参考区间】 结果分析注意事项： 1、样本需随机计数细胞。 2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。 3、杂交不均匀的区域不要分析。 4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。 5、背景深影响信号判断的区域不要分析。 6、计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定。 7、在分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位（需由病理科医 师认定）。 8、如果超过 25％的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。 8、如果超过 10％的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。 10、首先判定玻片杂交的充分性
核形态：肿瘤细胞核的边界通常是清晰的，并且细胞核呈完整的形态； 背景状态：背景不应该含有影响计数的颗粒物质存在； 荧光信号强度：信号应该是亮的、明显的和易计算的。信号应该存在于亮 光、椭圆形的。避免过分分散的信号。 此外，目标区域必须包含至少 50 个测定细胞； 11、定位目标观测区域 使用低倍物镜 DAPI 滤光片观察杂交区域； 坏死组织和细胞核的边界容易模糊，观察时应避免此区域，同时应该避开 细胞核染色不足的区域； 12、目标区域的荧光信号观察 使用 40×或 100×的物镜和适合的滤光片观察 ALK 信号。调节聚焦观察目标 信号和噪音（非目标杂交信号）的大小和形状。确保背景不具有强烈的荧光干 扰信号。 扫描整个组织区域，观察肿瘤细胞的整体荧光信号分布状态，选择较具代 表性的区域进行计数。 13、在目标区域内选择细胞并计数 选择细胞核分布较好的区域（如能区分单个细胞核的区域），并保证所选的 区域能够代表观察到的信号分布特征；开始分析细胞并记录每个细胞的荧光信 号特征；重复上述操作，直到技计数满 50 个细胞为止； 14、信号计数规则 14.1 调节聚焦数深度，找到细胞核中的信号所在部位。根据图 1 中的计数指南， 对所选择的具有明显界限的肿瘤间期细胞进行计数。 14.2 以下情况细胞为阴性（ALK 基因非重排）： 橙色和绿色信号相邻或融合（在橙/绿双通滤光片下观察为黄色）。橙色和绿 色信号分离，但是距离小于或等于两个信号直径的大小，这种情况也视为融合 信号（图 2，第一组）。 单独存在一个绿色荧光信号，不伴有相应的橙色信号（图 2，第一组） 14.3 以下情况细胞为阳性（ALK 基因重排）： 至少有一组橙色和绿色荧光信号分离的距离超出两个信号直径大小（图 2，
无
信
杂交条件不合适
号
确保遵守杂交所规定的时间和温度； 橡皮胶封片时勿留缝隙； 根据情况，调整杂交时间和湿度。
或
确保按照产品说明书要求配制洗脱液； 洗脱液或洗脱条件不正
信
确
确保洗脱液的温度达到洗脱步骤所规定温度；
号
玻片浸入洗脱液前移去盖玻片。
微
确保探针-20℃避光保存；
弱
探针或标本玻片储存不 将未杂交玻片干燥后置于-20℃长期保存或者室温短期保
玻
够干净
片
确保洗脱液按说明书配制；
背 杂交后洗脱不充分
景
确保按说明书操作； 确保洗脱液温度正确；
过
移去盖玻片，重复洗脱步骤。
强
洗脱液使用时间太长或 确保洗脱液2-8℃储存，配制7天后或者经常使用的洗脱液
不正确储存
应丢弃。
移去盖玻片, 室温下将玻片置于1×洗脱液0.1NP/40/2×SSC
复
复染过弱
中浸泡5分钟。 将玻片依次置于70％、85％和100％的乙醇
ALK 基因断裂检测试剂盒（荧光原位杂交法）
说明书
【产品名称】
通用名称：ALK 基因断裂检测试剂盒（荧光原位杂交法） 英文名称：ALK Break Apart FISH Probe Kit
【包装规格】
10 人份/盒、20 人份/盒
【预期用途】
本产品用于定性检测福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）人非小细胞肺癌(NSCLC)组织 样本中间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排情况。以辅助诊断患者是否适合接受克唑替尼等 靶向药物的治疗。
【样本要求】
福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌组织或细胞。样本应根据实验室标准程序进行 采集，试剂盒检验样本的选择应由病理学专业人员执行。样本应避免与酸、强碱接触，并避 免过热。
选择的检验样本一般应在制备之后 6 周内进行 FISH 实验，否则可能会影响实验效果。 建议切片厚度不超过 5μm。
【检验方法】