ALK基因断裂检测试剂盒(荧光原位杂交法)

样板 1：典型信号模式
指南 A.分开的橙色或绿色信号视为一个信号。
B.模糊的或者是细长的 DNA 纤维视为一个信号（无论红色或是绿 色）。
C.两个相邻的橙色和绿色信号距离小于两个信号直径或者重叠，应 视为一个融合信号。
D. 如果扩散的信号临近或者相连，应视为一个融合信号。
E.两个相邻的信号距离小于两个信号直径，且大小和颜色均相同， 应视为一个信号（也就是一个信号分裂的情况）。
染
溶液中各1分钟进行梯度脱水后再复染。
过
弱
复染液陈旧或过度光照
确保复染液-20±3℃避光保存；
确保复染液未失效。
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信号特征 2：阳性
2：断裂分离或缺失绿色信号
2A.
2B. 这些细胞核包括重组或分离的信号，分开的距离超出两
个信号直径大小。
A．细胞核具有一种以上分离信号。
B．细胞核有融合的和分离的信号。
杂交后，在荧光显微镜下下可以观察到在 ALK 基因未发生断裂时，显示为红绿融合的 黄色信号。反之，ALK 基因发生断裂时，红色和绿色信号分开且距离大于两个信号直径的大 小，或者是一个单独的红色信号 2-6 。
本试剂盒包含 ALK 探针混合物和复染液 DAPI。
【主要组成成分】
试剂 ALK 探针
规格 10 人份 20 人份
图 2：ALK 信号计数指南
信号特征 1：阴性
1. 相邻的或融合的 红色和绿色信号
1A.
1B. A.和 B.这些样本包含融合的红色或绿色信号。这些信
号为重叠的或为相邻的，或分开的距离不足两个信号直
径大小。
C.除了融合和/或断裂分离信号之外，还单独存在一个
绿色信号却不伴有相应的红色信号，这表示 ALK 探针
1C.
红色部分消失，视为阴性。药物作用的目标区域位于橙
色探针结合区域。
不计数只包括一种颜色荧光信号的细胞核。
问 可能的原因
题
推荐的解决方案
标本及探针变性不充分
确保玻片进行变性时温度在83±2℃； 将玻片变性时间延长2-4分钟。
玻片干燥不充分
探针滴加至玻片前，确保玻片上的乙醇溶液已经完全挥发。
杂交时盖玻片下有气泡 放盖玻片时要覆盖探针表面，轻轻挤压以便挤出气泡。
一、样本收集及玻片制备： 1、样本于常温下在10%中性福尔马林缓冲液中固定6~48小时，为了达到最佳 的和均匀的固定与石蜡包埋效果，样本大小不宜超过0.5cm3。 2、标准操作和石蜡包埋，使用高质量的石蜡。渗透和包埋应在低于65℃下进 行。 3、切成3μm厚的切片。 4、切片捞于有氢化硅涂层玻片或黏性玻片并在50~60℃环境中固定2~16 小时。 二、玻片预处理程序： 1. 56-65℃左右烤片过夜（至少 3 小时以上）。 2. 提前预热胃蛋白酶处理液（2mg/ml，10mM HCl），使其温度达到 37℃保温 备用。 3. 二甲苯中室温放置切片 10 分钟，重复该步骤两次。 4. 100%乙醇中室温放置切片 5 分钟，重复该步骤一次。 5.依次 85%、70%乙醇中室温放置切片 3 分钟。 6.去离子水洗涤三次。 7.用微波炉将适量的预处理缓冲液煮沸后，然后使其处于保温状态，放入切片 修复 20mins，或是在高压锅内加入适量的预处理缓冲液，高压修复 5min。 8. 取出玻片，用去离子水洗涤三次。将切片直接放入胃蛋白酶消化液中，消化 15±10mins。 注：根据不同的多种因素，如片子固定的条件与过程，片子厚度，组织/细胞的 特性，消化时间可以不同，我们建议：对于组织切片样本消化 5-25 分钟，对 于细胞样本消化 3-8 分钟。一般来讲，我们建议预实验找到样本的最佳消化时 间。且每次消化不超过 4 张切片。 9. 去离子水清洗 2mins，两次。 10. 脱水：70%，85%，100%乙醇溶液中依次放置 2 分钟，空气干燥切片。
三．FISH 操作步骤 警告和预防
荧光基团遇强光会产生光漂白现象。将含有荧光基团的试剂与玻片置于暗 处有助于减少此效应。所有不需光照的步骤（例如：孵育、洗涤等）均在暗处 进行。 （一）标本变性与杂交 1. 将含有的ALK探针的杂交液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器吸10μl至各个 样本。均匀滴加探针到整个目标区域；或者加探针到盖玻片中央，再将目标区 域反扣到盖玻片上。 2. 样本盖上盖玻片(20 mm×20 mm)，避免气泡；封片胶封片。 3. 将玻片放入杂交仪中反应，83℃（±2℃）变性 6 分钟，40℃过夜杂交。 注意：杂交期间片子绝对不能干！ （二）杂交后的处理 1、小心除去封片胶。 2、将切片置于0.1%NP-40/2×SSC溶液中，孵育10min，除去盖玻片。 3、将切片置于0.3%NP-40/2×SSC洗液（提前30min水浴加热到73±1℃）中，上
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第 2 组）。 除了融合和/或分离的信号之外，单独存在一个橙色荧光信号，不伴有相应
的绿色荧光信号（图 2，第 2 组）。
图 1：ALK 信号计数指南
红色信号 绿色信号 相邻或弥散的红绿信号
样本是无效的。
【检测方法的局限性】 本试剂盒采用荧光原位杂交技术用于非小细胞肺癌ALK基因重排检测，不能用于其他
正确
存（一般不超过两星期）；
将杂交后玻片置于-20℃避光保存。
观察时所选用的滤片组 不合适
使用正确滤片组观察探针荧光情况。 详情请咨询河南赛诺特生物技术有限公司技术服务部门。
显微镜构造及物镜不适 宜观察FISH标本，或者 滤片组损伤
请联系显微镜制造商。
标本制作前玻片清洗不
将玻片浸入无水乙醇中，滴片前用无绒纸巾擦干。
100μl
200μl
主要成分 荧光标记探针、甲酰胺、SSC、硫酸葡聚糖
DAPI
0.5ml
0.5ml
DAPI/抗褪色液、甘油
【储存条件及有效期】
ALK 基因断裂检测试剂盒于-20±3℃密封避光储存； 自生产之日起有效期为一年。
【适用仪器】
本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交，如 ThermoBrite 等。 本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果。所需荧光显微镜的配置包括： 物镜：在 FISH 分析上，使用 100×消色差浸油类型物镜可取得满意效果。 镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在荧光显微镜上 使用。 滤光片：建议顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便 选择与标记荧光染料相适应的滤片组。 绿色荧光：激发波长为 496nm，发射波长为 520nm，与 FITC 类似 橘红色荧光：激发波长为 551nm，发射波长为 572nm，与 Rhodamine 类似
基因突变方式的检测。 【注意事项】 1、供体外检测使用。 2、本试剂盒实验操作过程中，需戴乳胶手套操作，避免试剂接触肌肤。如不慎接触，立即
用大量水冲洗。 3、实验过程中的废弃样本及实验废弃物，需作为医疗废物统一回收处理 4、为得到理想的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。 5、实验过程中的常见问题及处理方法(见下表)：
本检测必须经医生批准方可检测使用，用以帮助判断患者是否适合接受非小细胞肺癌 (NSCLC)的相关药物治疗1,4。
【检验原理】
荧光原位杂交法（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）能够使细胞中特定的核苷酸 片段通过荧光而清楚的呈现，FISH 试验过程中包含了双链 DNA 的解链，荧光标记的 DNA 探针能够与目标序列结合[2-3]。杂交完成之后，多余的探针被清洗掉，同时，细胞核被复染剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色的荧光。
下提拉切片1-3s，放置2mins。 4、室温条件下，将切片置于0.1%NP-40/2×SSC洗液中，上下提拉1-3s，处理切 片3mins。 5、在70%、85%的乙醇溶液中依次处理切片2mins。 6. 避光晾干样本。 注：洗液缸中每次最好同时处理4张切片，当最后一张玻片放入考普林缸时开 始计时。 （三）观察 1. 滴加10 μl DAPI复染液到切片组织上，盖上盖玻片，避免气泡，暗处-20℃孵 育30分钟。 3. 荧光显微镜下观察。 （四）储存 完成杂交的玻片置于-20℃避光储存。 【结果阳性判断及参考区间】 结果分析注意事项： 1、样本需随机计数细胞。 2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。 3、杂交不均匀的区域不要分析。 4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。 5、背景深影响信号判断的区域不要分析。 6、计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定。 7、在分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位（需由病理科医 师认定）。 8、如果超过 25％的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。 8、如果超过 10％的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。 10、首先判定玻片杂交的充分性
核形态：肿瘤细胞核的边界通常是清晰的，并且细胞核呈完整的形态； 背景状态：背景不应该含有影响计数的颗粒物质存在； 荧光信号强度：信号应该是亮的、明显的和易计算的。信号应该存在于亮 光、椭圆形的。避免过分分散的信号。 此外，目标区域必须包含至少 50 个测定细胞； 11、定位目标观测区域 使用低倍物镜 DAPI 滤光片观察杂交区域； 坏死组织和细胞核的边界容易模糊，观察时应避免此区域，同时应该避开 细胞核染色不足的区域； 12、目标区域的荧光信号观察 使用 40×或 100×的物镜和适合的滤光片观察 ALK 信号。调节聚焦观察目标 信号和噪音（非目标杂交信号）的大小和形状。确保背景不具有强烈的荧光干 扰信号。 扫描整个组织区域，观察肿瘤细胞的整体荧光信号分布状态，选择较具代 表性的区域进行计数。 13、在目标区域内选择细胞并计数 选择细胞核分布较好的区域（如能区分单个细胞核的区域），并保证所选的 区域能够代表观察到的信号分布特征；开始分析细胞并记录每个细胞的荧光信 号特征；重复上述操作，直到技计数满 50 个细胞为止； 14、信号计数规则 14.1 调节聚焦数深度，找到细胞核中的信号所在部位。根据图 1 中的计数指南， 对所选择的具有明显界限的肿瘤间期细胞进行计数。 14.2 以下情况细胞为阴性（ALK 基因非重排）： 橙色和绿色信号相邻或融合（在橙/绿双通滤光片下观察为黄色）。橙色和绿 色信号分离，但是距离小于或等于两个信号直径的大小，这种情况也视为融合 信号（图 2，第一组）。 单独存在一个绿色荧光信号，不伴有相应的橙色信号（图 2，第一组） 14.3 以下情况细胞为阳性（ALK 基因重排）： 至少有一组橙色和绿色荧光信号分离的距离超出两个信号直径大小（图 2，
无
信
杂交条件不合适
号
确保遵守杂交所规定的时间和温度； 橡皮胶封片时勿留缝隙； 根据情况，调整杂交时间和湿度。
或
确保按照产品说明书要求配制洗脱液； 洗脱液或洗脱条件不正
信
确
确保洗脱液的温度达到洗脱步骤所规定温度；
号
玻片浸入洗脱液前移去盖玻片。
微
确保探针-20℃避光保存；
弱
探针或标本玻片储存不 将未杂交玻片干燥后置于-20℃长期保存或者室温短期保
玻
够干净
片
确保洗脱液按说明书配制；
背 杂交后洗脱不充分
景
确保按说明书操作； 确保洗脱液温度正确；
过
移去盖玻片，重复洗脱步骤。
强
洗脱液使用时间太长或 确保洗脱液2-8℃储存，配制7天后或者经常使用的洗脱液
不正确储存
应丢弃。
移去盖玻片, 室温下将玻片置于1×洗脱液0.1NP/40/2×SSC
复
复染过弱
中浸泡5分钟。 将玻片依次置于70％、85％和100％的乙醇
ALK 基因断裂检测试剂盒（荧光原位杂交法）
说明书
【产品名称】
通用名称：ALK 基因断裂检测试剂盒（荧光原位杂交法） 英文名称：ALK Break Apart FISH Probe Kit
【包装规格】
10 人份/盒、20 人份/盒
【预期用途】
本产品用于定性检测福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）人非小细胞肺癌(NSCLC)组织 样本中间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排情况。以辅助诊断患者是否适合接受克唑替尼等 靶向药物的治疗。
【样本要求】
福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌组织或细胞。样本应根据实验室标准程序进行 采集，试剂盒检验样本的选择应由病理学专业人员执行。样本应避免与酸、强碱接触，并避 免过热。
选择的检验样本一般应在制备之后 6 周内进行 FISH 实验，否则可能会影响实验效果。 建议切片厚度不超过 5μm。
【检验方法】