4、实验四 细胞器的分离
《细胞生物学实验》教学大纲
《细胞生物学实验》教学大纲课程名称：细胞生物学实验课程编号：12030037课程类别：专业基础课/必修课学时/学分： 24/0.75开设学期：第四学期说明一、课程性质细胞生物学实验是生物科学和生物工程专业一门重要的必修基础课程，在生命学科的本科教学中有着十分重要的地位。
通过实验，不仅使学生加深对细胞生物学理论知识的理解和认证，同时通过对细胞生命现象的观察和亲手操作，使学生获得有关细胞生命活动的感性知识，有效地提高理论课的教学效果，并使学生掌握细胞生物学实验的基本原理、方法和技能，培养和提高学生实验设计和应用各种实验技术的能力，培养和训练学生的创新意识和创新能力，培养严谨的科学态度和实事求是的作风，提高发现问题、分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事教学或科学研究打下坚实的基础。
二、教学目标通过细胞生物学实验，使学生们更加牢固地掌握细胞生物学基本知识和基本理论，对细胞的结构和功能有全面、真实的认识，使学生们掌握细胞生物学的基本实验方法和技能。
三、学时分配表序号实验项目实验时数实验类型内容与要求小计实验1细胞膜的渗透性及细胞凝集反应4设计性了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度，掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝集的原理实验2叶绿体的分离与荧光观察3验证性掌握荧光显微镜的原理和使用方法；观察叶绿体的自发荧光与次生荧光；通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法实验3植物细胞骨架的观察4验证性掌握光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法实验4鸡血细胞的体外融合6综合性了解PEG诱导细胞融合的基本原理，通过PEG诱导鸡红细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合技术实验5巨噬细胞吞噬现象的观察7综合性通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的活动观察，加深理解细胞吞噬作用的过程和意义；掌握小白鼠腹腔注射给药方法和颈椎脱臼处死法合计24四、实验方法与要求建议本课程采用传统的实验教学方法，2人一组操作，结合多媒体、小组讨论与集体讨论、实验设计、教学录像、细胞生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握细胞生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，以提高学生从事教学和科学研究的综合素质。
【新教材生物一轮复习】必修1 第2单元 第2讲 细胞器之间的分工合作
类和包装 的“车间”及“发送站”。
4．④内质网：蛋白质等大分子物质的合成、加工场所和运输通 道__。
5．⑤液泡：内有细胞液，调节植物细胞内的环境，充盈的液泡 还可以使植物细胞保持坚挺，主要存在于植物细胞中。
6．⑥溶酶体：细胞内的“消化车间”，内部含有多种水解酶， 能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死 侵入细胞的病菌或病毒。
细胞结构中的“一定”与“不一定” (1)具有细胞壁的细胞不一定是植物细胞，如真菌、细菌等都有 细胞壁(注意细胞壁的组成成分不同)。 (2)能进行光合作用的生物，不一定有叶绿体(如蓝细菌)，能进行 有氧呼吸的生物不一定有线粒体(如好氧细菌)。
(3)蛋白质合成场所一定是核糖体，核糖体的形成不一定都与核仁 有关(如原核细胞没有核仁，但有核糖体)。
的选择透过性。
( ×)
提示：依赖于生物膜的流动性。
4．生物膜之间通过囊泡运输依赖膜的流动性且不消耗能量。 ( ×)
提示：囊泡运输消耗能量。
5．分泌蛋白先经过高尔基体再经过内质网分泌到细胞外。 ( ×)
提示：分泌蛋白先经过内质网，再经过高尔基体分泌到细胞外。
6．CO2 的固定、水的光解、蛋白质的加工均在生物膜上进行。 ( ×)
C [a 为线粒体，NADH 与氧结合形成水是有氧呼吸第三阶段， 该反应发生在线粒体内膜上，线粒体内膜折叠形成嵴，A 正确；b 为 叶绿体，直接参与光合作用的膜是类囊体薄膜，膜上有光合色素， 发生光反应，B 正确；与光合作用有关的酶没有分布在叶绿体内膜上， C 错误；线粒体中发生化学能转化成热能，叶绿体发生光能转化成 化学能，两者可共存于同一个细胞中，D 正确。]
细胞器的观察
实验四细胞器的观察【目的要求】1、掌握光镜下线粒体、高尔基复合体和中心体等细胞器的形态和分布2、初步掌握某些细胞器的活体染色方法。
【实验原理】在真核细胞中存在着多种具有特殊形态结构和功能的细胞器,如线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体、中心体、微管、微丝和核糖体等。
这些细胞器中有的经过特殊的染色后在光镜下就可被观察到，而有些细胞器由于体积非常微小只有在电镜下才可见到。
在光镜下可见线粒体常呈颗粒状、棒状或弯曲的线状，如图4-1。
线粒体的形态和数量随不同生物、不同组织及不同生理状态而发生变化，例如肝细胞、胰细胞的线粒体通常呈线状；成熟的卵细胞内线粒体呈颗粒状；肾细胞内的线粒体常呈棒状。
线粒体含有细胞色素氧化酶系统，当用Janus Green B（詹纳斯绿B）专一性地对线粒体进行活体染色时，其线粒体内膜和嵴膜的细胞色素氧化酶可使Janus Green B染料始终处于氧化状态而呈蓝色，而在线粒体周围的细胞质中的Janus Green B被还原呈无色。
用特殊的固定液染色处理动物的组织或细胞后，也可显示出线粒体的形态。
线粒体的组成成分主要是脂蛋白，脂类又以磷脂为主。
由于线粒体中蛋白质、磷脂含量很高，故有大量的羧基和磷酸基阴离子基因，使带阳离子的铁、苏木精很容易与其结合而着色，使线粒体显示出来。
高尔基复合体用硝酸钴固定后，再经硝酸银染粒浸染制成永久切片，由于组成高尔基复合体的物质具有还原银盐的能力，可使其呈现棕褐色沉淀，因而能显示出高尔基复合体的形态和位置。
【器材与试剂】器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、吸管、小镊子、吸水纸。
材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏切片、兔脊神经节切片、马蛔虫子宫切片、小白鼠。
试剂：中性红；詹纳斯绿染液。
试剂的配制：⑴中性红-詹纳斯绿染液① 5.18%詹纳斯绿饱和溶液3滴100%詹纳斯绿饱和溶液5ml中性红(1:15000) 1ml② 5.65%中性红饱和水溶液20~30滴100%酒精5ml将①和②液混合在一起，即配成所需的中性红-詹纳斯绿染液。
细胞生物学实验材料
实验一荧光显微镜的原理和使用实验二叶绿体的分离与荧光观察实验三线粒体的活体染色与观察实验四细胞膜的通透性实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应实验六植物染色体标本的制备和观察实验七细胞计数实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验九植物原生质体的分离和活性鉴定实验十环境因素诱变染色体改组的观察实验一荧光显微镜的原理和使用一、实验目的了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。
二、实验原理荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。
与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。
所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。
在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生图1荧光显微镜发射光（即荧光）。
因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。
某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
三、实验用品荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。
分离细胞器的方法
分离细胞器的方法细胞器是细胞内的重要结构，它们在细胞的生存和功能执行中起着至关重要的作用。
分离细胞器是细胞生物学和生物化学研究中的重要操作，可以帮助科研人员更好地了解细胞器的结构和功能。
下面将介绍几种常用的分离细胞器的方法。
一、差速离心法。
差速离心法是一种常用的分离细胞器的方法，通过利用细胞器的不同密度来进行分离。
首先，需要将细胞悬液置于离心管中，然后进行低速离心，使细胞器沉淀到离心管底部。
接下来，将上清液转移到另一个离心管中，进行高速离心，这样可以将不同密度的细胞器分离出来。
通过这种方法，可以获得相对纯净的细胞器样品。
二、梯度离心法。
梯度离心法是利用密度梯度离心离心细胞器的方法。
首先，需要制备密度梯度离心液，然后将细胞悬液均匀地加在离心管上，进行超速离心。
在离心过程中，不同密度的细胞器会在密度梯度中分层沉淀，从而实现分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器。
三、超声破碎法。
超声破碎法是一种利用超声波对细胞进行破碎，分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液置于超声破碎仪中，经过超声波的作用，细胞膜会破裂，释放出细胞器。
然后，通过差速离心或梯度离心的方法，可以将细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
四、亲和层析法。
亲和层析法是利用生物分子之间的特异性相互作用来分离细胞器的方法。
通过将含有特定亲和基质的层析柱与混合细胞器悬液一起进行层析，利用细胞器与亲和基质之间的特异性结合来实现细胞器的分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器样品，适用于对细胞器纯度要求较高的实验。
五、离心上清法。
离心上清法是一种简单快捷的分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液进行差速离心，将上清液收集起来。
然后，通过连续的离心步骤，可以逐渐将不同密度的细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
总结。
以上介绍了几种常用的分离细胞器的方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据实验的需要选择合适的方法进行细胞器的分离，以获得满意的实验结果。
细胞生物学实验习题
细胞生物学实验习题实验一利用各种显微镜观察细胞形态、结构1.简述显微镜的主要结构和操作要领。
2.分析在使用低倍镜、高倍镜和油镜时，对光亮度的要求。
3.分析聚光镜在成像质量中的作用。
实验二显微摄影1.要想得到一张完美的显微摄影照片，应注意哪些方面的问题，主要关键是什么2.结合数码互动显微镜摄影操作，写出操作工程、拍摄关键点以及注意事项。
实验三细胞的亚显微结构观察1.比较光镜与电镜工作原理的区别。
2.分析扫描电镜与透射电镜的主要异同点。
实验四细胞膜的渗透性1.讨论溶血实验在研究中应用的可能性。
实验五动物细胞培养及其生长特性的观察分析1.哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么3.血清在细胞培养中有何作用4.为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理5.配制培养基时调节pH值的目的是什么6.细胞传代培养的目的是什么7.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同8.如何防止传代过程中不被微生物污染9.悬浮细胞和贴壁细胞在计数时有何不同10.讨论细胞存活率在研究中的应用和意义。
实验六细胞器的分离与观察1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。
要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质L 及L 缓冲蔗糖溶液哪一种在下层有什么作用实验七细胞骨架的观察1.微丝观察实验中，1% Triton X -100 处理细胞的作用是什么2.微丝观察实验（考马斯亮蓝R 250 染色法观察微丝）中，是否能看到微管、中间纤维为什么3.M –缓冲液的作用是什么4.说明细胞中由微丝组成的结构及其功能。
实验八细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的形态特征的观察1.总结凋亡细胞的形态特征。
2.试述本实验鉴别凋亡细胞、坏死细胞核正常细胞的原理。
叶绿体的分离与观察
2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min。
3、将匀浆用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。
4、取滤液4mL在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。
5、将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
6、沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
7、取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后在普通光学显微镜下观察。
二、菠菜叶手切片观察
用刀片将新鲜的嫩菠菜叶切一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖玻片后轻压，置显微镜下观察。
实验结果
一、叶绿体的分离与观察：在显颗粒－基粒。
实验用品
一、仪器
1．主要设备：普通离心机、组织捣碎机、普通光学显微镜。
2．500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，载玻片、盖玻片、刀片等。
二、材料：新鲜菠菜
三、试剂：0.35mol/L NaCl溶液
实验方法
一、叶绿体的分离与观察
1、选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于150mL 0.35mol/L氯化钠溶液中，装入组织捣碎机中。
植物细胞分离实验报告
一、实验目的1. 熟悉植物细胞分离实验的基本原理和方法。
2. 掌握植物细胞器分离纯化的操作技能。
3. 了解不同细胞器在分离过程中的沉降特性。
二、实验原理植物细胞分离实验是细胞生物学和分子生物学研究的重要技术之一。
通过采用差速离心和密度梯度离心等方法，可以将植物细胞中的各种细胞器分离纯化，从而研究其结构和功能。
本实验采用差速离心法分离植物细胞中的线粒体和叶绿体。
三、实验用品1. 植物材料：洋葱鳞片叶或菠菜叶片。
2. 实验试剂：生理盐水、蔗糖、盐酸、缓冲液、龙胆紫染液。
3. 实验仪器：离心机、匀浆器、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、培养皿、铅笔。
四、实验步骤1. 细胞破碎：将植物材料放入匀浆器中，加入适量生理盐水，高速匀浆，破碎细胞。
2. 差速离心：将匀浆液转移至离心管中，以3000r/min的速度离心10分钟，分离出细胞碎片。
3. 叶绿体分离：将离心后的上清液转移至新的离心管中，以5000r/min的速度离心10分钟，分离出叶绿体。
4. 线粒体分离：将离心后的沉淀物重新悬浮于生理盐水中，以12000r/min的速度离心15分钟，分离出线粒体。
5. 染色：将分离出的线粒体和叶绿体分别加入适量龙胆紫染液，染色5分钟。
6. 观察：将染色后的线粒体和叶绿体分别滴在载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察。
五、实验结果1. 叶绿体：呈绿色，呈球形或椭球形，细胞器较大，直径约2-4微米。
2. 线粒体：呈蓝色，呈杆状或圆形，细胞器较小，直径约0.5-1微米。
六、实验讨论1. 在差速离心过程中，不同细胞器的沉降速度不同，因此可以通过调整离心速度和时间，实现细胞器的分离纯化。
2. 本实验中，叶绿体和线粒体的分离效果较好，说明差速离心法适用于植物细胞器的分离。
3. 实验过程中，要注意控制匀浆时间和离心速度，以免影响细胞器的结构和功能。
七、实验结论本实验成功分离出植物细胞中的叶绿体和线粒体，并通过显微镜观察了其形态特征。
细胞器的分离实验原理及步骤
实验二十二细胞器的分离一．实验目的：以大鼠肝为例，介绍用差速离心法分离细胞器的一般操作程序二．实验原理：（略）三．试剂和器材（一）试剂：１.生理盐水2 . 0.25mol/L 蔗糖-0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）。
配法：0.1mol/L Tris 10ml 0.1mol/L盐酸 8.4ml 加双蒸水到100ml。
再向上述缓冲溶液中加蔗糖，使浓度为0.25mol/L。
蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖。
3. 0.34mol/L 蔗糖-0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）。
4. 0.34mol/L 蔗糖-0.5mmol/L Mg（AC）2溶液，用1mol/L NaOH调pH到7.4。
5. 0.88mol/L 蔗糖-0.5mmol/L Mg（AC）2溶液， pH7.4。
6. RSB溶液：0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.2）,0.01mol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl27. 比重d20=1.18的蔗糖溶液（51.5g/L）。
比重d20=1.16的蔗糖溶液（51.0g/L）。
8. 1%詹纳斯绿（Janus green B）染液，用生理盐水配制9. 甲基绿-派洛宁染液。
配法：甲液：2%甲基绿水溶液 14ml 5%派洛宁水溶液 4ml 蒸馏水 16ml 乙液：0.2mol/L 醋酸缓冲液（pH4.8）16ml将甲液和乙液混合均匀，此染液不宜久置。
10. 卡诺固定液无水乙醇 6ml 冰醋酸 1ml 氯仿 3ml11. 丙酮。
细胞核及线粒体的分级分离实验报告
细胞核及线粒体的分级分离实验报告下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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细胞实验教案1.
细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。
二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
三、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
细胞和细胞器及间质的分离
第三章细胞和细胞器及间质的分离细胞内各种结构的比重、大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，所以常用不同介质、不同转速、不同时间，通过分级离心，将细胞内各种结构组分（细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等）分离出来。
主要方法是：组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。
一、细胞的分离根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。
其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例，也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例，假设细胞为球形，则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示V= 2g(ρc–ρs)r²9η遵循Stokes定律，其中：ρc和ρs分别是细胞和溶液的密度，η为溶液粘度，r为细胞半径，g为重力加速度。
根据细胞直径（大小）的分离方法：主要是速度下降。
细胞在单位引力下，通过低密度介质，或在低离心力作用下，通过密度梯度沉降。
由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞越大沉降越快。
根据细胞密度分离是等密度分离，就是细胞在连续密度梯度分离介质中，在强离心作用下，细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面，并能保持平衡，在非连续密度梯度中，分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上，从而达到分离。
操作方法：（一）单位重力沉降法：分离介质主要是牛血清白蛋白，其分离的细胞活性高、费用也昂贵。
现已用蔗糖替代，仍能取得较好的分离效果。
1．在固定沉降池上方加入30ml PBS/BSA，含有细胞1×108于池底。
2．从池周边加入50ml PBS覆盖于样品上，不要使整个界面破坏。
3．下口接1％蔗糖梯度液，稍松下口，缓慢放入50ml 1%蔗糖梯度液，约10ml/min。
4．接通梯度混合仪，从下口加入1200ml 1~2%蔗糖梯度液，速度为50ml/min。
5．最后加入500ml 2.5%蔗糖梯度液。
6．整个沉降系统，于4℃，静置4h，这时细胞按大小先后沉降，未成熟的红细胞在先，成熟的网织红细胞在最后。
细胞组分分级分离实验报告
细胞组分分级分离实验目的分级分离细胞核和线粒体实验原理1.相关概念细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。
常用分离方法：差速离⼼法——不同转速；密度梯度离⼼法——不同浓度的介质2.分离方法（1）差速离⼼法特点：介质密度均⼀；离⼼⼒由低向⾼；逐级离⼼（差速）。
⽤途：初步分离；分离⼤⼩相差悬殊的细胞组分。
细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、⾼尔基体→核糖体（2）密度梯度离⼼法特点：介质密度不均⼀；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速）⽤途：纯化分离细胞器等颗粒组分待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围常⽤介质及要求：蔗糖、⽢油、氯化銫；能产⽣密度梯度，且密度⾼时，粘度不⾼；PH中性或易调为中性；浓度⼤时渗透压不⼤；对细胞⽆毒3.染色方法甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。
詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。
实验设计思路实验结果分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。
如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。
注意事项1.过滤前要先将纱布湿润2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃)3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。
4.离心机温度应设为4℃5.整个分离过程不宜过长,要尽快。
6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。
分离细胞器的方法
分离细胞器的方法一、质量提取法：1.质量提取是一种常用的分离细胞器方法。
首先，将细胞均匀悬浮在适当的缓冲液中，以破坏细胞的完整结构，使细胞器从细胞中释放出来。
然后，通过离心使细胞器分离出来。
最后，用适当的方式纯化和分离所需的细胞器。
二、差速离心法：1.差速离心是常用的分离细胞器的方法之一。
通过不同离心速度来分离不同种类的细胞器。
采用逐步递增离心速度的方法，较重的细胞器首先沉降，然后逐渐轻细的细胞器依次沉降。
可以通过调整离心条件，如离心时间、离心速度和离心温度等，来实现对特定细胞器的精确分离。
三、密度梯度离心法：1.密度梯度离心是一种通过调节溶液密度梯度来分离细胞器的方法。
将含有细胞器的混合物加入离心管中，然后在离心过程中离心管中形成上下不同密度的溶液梯度。
通过离心，细胞器会在溶液梯度中向上或向下移动，最终在特定密度的位置上分离出来。
这种方法可以分离很多种细胞器，对细胞器纯化效果好。
四、超高速离心法：1.超高速离心是一种通过高速离心迅速分离细胞器的方法。
这种方法需要使用特殊的离心机，离心速度可以达到非常高的数万转/分钟。
高速离心时，细胞器受到离心力的作用，向离心管底部沉降。
通过不同的离心时间和速度，可以有效地分离出不同种类的细胞器。
超高速离心法对于分离某些细胞器效果更好，但需要设备支持。
五、表面标记法：1.表面标记是一种通过特定标记分子来分离细胞器的方法。
在细胞器表面标记上特定的抗原或蛋白，然后使用特异性抗体或亲和素来识别和结合标记的细胞器。
通过这种方式，可以将特定的细胞器从混合物中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，适用于某些细胞器无法通过其他方法有效分离的情况。
以上是常用的分离细胞器的几种方法，不同的方法适用于不同的实验需求，可以选择合适的方法进行细胞器的分离和纯化。
06实验六--细胞器的分离与观察nj
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。
(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细 胞器及其包含物的匀浆。
洋葱内表皮细胞的线粒体分布
植物根尖液泡的中性红染色
三、材料和试剂
材料：小鼠的肝脏
器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
这样不同大小形态密度的颗粒就会以不同的速度向下移动集中到不同的区域可以分别收细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液因为它比较接近细胞质的分散相在一定程度上能保持细胞器的结构和功能保持酶的活性避免细胞器的聚集
实验六 细胞器的分离与观察
一、细胞核的分离与观察 二、线粒体的分离与观察
一、实验目的
细胞器的分离方法
细胞器的分离方法
细胞器的分离主要分为物理法和化学法两类。
1、物理法：该方法主要是通过改变细胞内外环境的渗透压，使细胞器发生变形或破裂，使细胞器和细胞质分离。
其中普遍采用的有浓缩法、磁选法、离心法和拆离弹簧杆法等。
2、化学法：利用人工合成的表面活性剂，改变细胞表面电荷，使细胞器和细胞质分离。
其中普遍采用的有抑制剂法、蛋白质酶共沉淀法、离子交换法、反相色谱法、聚丙烯酰胺树脂快速层析法等。
总的来说，细胞器的分离依赖于细胞内外环境的变化，从而起到分离细胞器和细胞质的作用。
只要根据不同的细胞类型和要求，正确选择适当的分离方法，就可以获得足够纯度的细胞器样品。
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①、②、③片，自然干燥后，放入Giemsa染 液缸中染色5min，用蒸馏水洗去染液，镜检。 ④片先滴1—2滴健那绿B于玻片上，挑少许沉 淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 5min ⑤片先滴1—2滴健那绿B于玻片上，滴一滴上 清液在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。
作业
描述鉴定观察的五张片子的结 果。
实验四
细胞器的分离
一、实验目的
1. 了解用差速离心的方法分级分离细胞组分 的原理和过程。 的原理和过程。 2. 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验原理
细胞内各种结构的密度、形状、大小各不相同， 细胞内各种结构的密度 、形状、大小各不相同 ，因此它们在同 一离心场内的沉降速率就不相同。 一离心场内的沉降速率就不相同。 而且在进行沉降时各自要求 的离心力也不相同。差速离心的方法就是根据这一原理， 的离心力也不相同。差速离心的方法就是根据这一原理， 利用 不同的离心速度所产生的离心力，将各种亚细胞组分和颗粒分 不同的离心速度所产生的离心力， 别分离开。当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底； 别分离开。 当离心力低 ，离心时间短时，细胞核即可沉到管底； 加大离心力后，又可分离出线粒体：离心力再加大， 加大离心力后，又可分离出线粒体 ：离心力再加大，又能分离 出微体和核糖体。 出微体和核糖体。 除了差速离心法， 除了差速离心法，还可也使用在差速离心法基础上改进产生的 密度梯度离心法来进行细胞亚组分的分离。 密度梯度离心法来进行细胞亚组分的分离。这一方法是使离心 溶液含有密度逐步增加的（密度梯度）极易溶解的惰性物质， 溶液含有密度逐步增加的（ 密度梯度） 极易溶解的惰性物质， 例如蔗糖，利用这一密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流。 例如蔗糖， 利用这一密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流。 操作时，将细胞匀浆液置于离心管的最上层，随后离心，这样， 操作时，将细胞匀浆液置于离心管的最上层， 随后离心，这样， 不同大小、形状、密度的细胞结构，由于它们的沉降系数不同， 不同大小、 形状、密度的细胞结构 ，由于它们的沉降系数不同， 就会以不同的速率向下移动， 就会以不同的速率向下移动，分别集中到相应的密度区带而得 以分离。 以分离。
↓2000 rpm离心淀 上清液 →作涂片② 作涂片 ↓加预冷蔗糖液至 ，吹打均匀 加预冷蔗糖液至8ml， ↓11000 rpm离心 min，弃上清液 离心10 离心 ， 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心 min，弃上清液 ↓加预冷蔗糖液，吹打均匀 离心10 加预冷蔗糖液， 离心 ， 加预冷蔗糖液 沉淀 混合液 ↓加1ml蔗糖液，混匀 蔗糖液， ↓11000 rpm离心 min 离心10 蔗糖液 离心 作涂片③ 作涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 取少许于载片, 取少许于载片 取1滴于载片 滴于载片 加健那绿B 混匀④ 加健那绿B 混匀⑤ 加健那绿 混匀④ 加健那绿 混匀⑤
用另一玻片轻触液滴前端
载玻片
约1/4处，滴加液滴 处
图示： 图示：涂片制作过程
三、实验步骤: 实验步骤
蛙肝 ↓冷生理盐水 冷生理盐水10ml洗，吸干水分，放在小烧杯中 洗 吸干水分， ↓加入预冷蔗糖液 少于 加入预冷蔗糖液(少于 少于9ml)，剪碎 ， 匀浆
↓纱布过滤 纱布过滤
滤液→做涂片① 滤液 做涂片① 做涂片