神经细胞体外培养的方法及的应用29页PPT
神经细胞培养
传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP）
少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
GFAP
human Schwann cells
3 神经干细胞（NSE）的培养： NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内 所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是 在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年 来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发 出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度 去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神 经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑肿瘤等神经系统 疾病寻求了一条新的途径 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞; 成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
５ 细胞的生长过程：
原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代 之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分 成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为 传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系： 原代培养 传代期 衰退期
ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor
原代神经元培养培训课件
精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。
80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
8)。
孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。
聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。
养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。
灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段;神经细胞培养的主要优点是:1分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会;2能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究;3易于施行物理如缺血、缺氧、化学和生物因子如神经营养因子等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用;4便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制,药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响; 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作,取得了一些经验,现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子NGF等神经营养因子的生物活性测定;在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性;1、材料和方法1选正常受精的鸡蛋,置于37℃生化培养箱内孵化,每日翻动鸡蛋一次;2取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳,从气室端敲开蛋壳,用消毒镊剥除气室部蛋壳;3用弯镊钩住鸡胚颈部,无菌条件下取出鸡胚置小平皿内,除去头部后,腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔,除去内脏器官;4在解剖显微镜下,小心除去腹膜,暴露脊柱及其两侧,在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节图1,用一对5号微解剖镊小心取出;5置背根节于解剖溶液内,用微解剖镊去除附带组织,接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中,在DMEM无血清培养液中培养;2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子NGF, ,20ng/ml的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起;而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长;二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节DRG细胞起源于神经嵴,NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明,外原性NGF 能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络;在体外,分离培养的神经节在NGF存在的情况下,神经突起的生长在一天之内可长达数毫米,因此,利用培养的DRG细胞,进行轴突生长发育的研究,是最为经典而常用的方法之一;1、材料和方法取新生一天的大鼠wistar种和小鼠昆明种;用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节;鸡胚背根神经节的取材方法同前; 剥除神经节被膜, 用%胰蛋白酶消化37℃ 30min分散后用种植Plating培养液稀释成×105 个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置;置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养;24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养Feeding培养液培养;接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml 和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液;2、培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 L;10%胎牛血清; 10%马血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml;脱氧核糖核酸酶I 40μg/ml;饲养培养液: 95%Eagle's DMEM含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 L,；5 % 马血清； NGF 20ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml;3、新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形,直径8-14μm, 胞体周围呈现一圈光晕;神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元;接种后24h, 大部分贴壁细胞开始长出突起;其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元, 突起细长,并可观察到突起末端的生长锥;除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起, 它们向四周发出树枝状的神经突起; 培养2-3d后神经元的突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的神经网络;随着培养时间的延长, 神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密, 神经元胞体逐渐增大;大鼠背根节神经元可维持培养2个月;4、新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与新生大鼠相似,但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小; 神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大;小鼠背根节神经元亦可维持培养2个月;5、鸡胚背根节神经元的生长分化和形态特征鸡胚背根节神经元的生长分化基本上亦与新生大鼠和小鼠相似;但鸡胚背根节神经元以假单极为多见; 与大鼠或小鼠背根节培养神经元相比,神经突起分枝较少;神经元胞体稍小,神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大;鸡胚背根节神经元亦可维持培养2个月;三、新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养交感神经系统在维持机体的正常功能和对环境的适应性反应中起着十分重要的作用;交感神经细胞培养特别有助于神经细胞发育和可塑性研究,利用体外培养系统可进行交感神经细胞的发生、死亡、形态和生化发育、递质表形的获得,以及靶组织与传入纤维的突触形成的研究;此外,通过体外培养系统可获得关于神经营养因子、激素,细胞因子等调节交感神经元发育的信息,了解传入纤维的输入以及与靶组织的联系的机制;1、材料和方法实验用出生当天的昆明种小鼠,在无菌条件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖镊在解剖显微镜下找到气管两侧的颈总动脉,并以此为标志,在颈总动脉分为颈内外动脉交叉处找到上颈交感节, 取出上颈交感节, 置于含 1 % 胶元酶Collagenase和1 % 消化酶Dispase的2ml混合消化液中消化37℃, 1 h分散后,用种植Plating培养液稀释成×105个细胞/ml密度的的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置;置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养;24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养Feeding培养液培养;接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液;2、培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 L；10%胎牛血清；10%马血清；NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml;脱氧核糖核酸酶I 40μg/ml;饲养培养液: 95%Eagle's DMEM含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 L,；5%马血清； NGF 20 ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml;3、新生小鼠交感节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠交感节神经元在含 NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄膜或在皮层胶质细胞层上生长, 交感神经元的胞体一般为圆形, 有时亦可见椭圆或梭形,体积较大, 直径约8-14μm左右,胞体周围呈现一圈光晕,神经元的细胞核大多偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元 ;接种后24h, 大部分贴壁神经元开始长出突起;培养2-3天后,神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络;随着培养时间的延长, 神经突起网络变得更加稠密;神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗, 神经元的胞体逐渐增大;小鼠交感神经元可维持培养1-2个月;四、胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养中枢神经系统包括脑和脊髓,脊髓是中枢的初级部分,其功能有二,一是传导感觉和运动冲动,二是完成躯体运动的基本反射;脊髓突然被横断并与高级中级失去联系后产生脊休克;因此,利用体外培养的脊髓腹角运动神经元进行脊髓损伤和修复的研究日益受到重视;1、材料和方法用12-14d 胚龄的小鼠、12-14d 胚龄的大鼠、孵化10 d 的鸡胚,在无菌条件下取出胎鼠或鸡胚脊髓,剥除脊膜后,将整个脊髓腹侧面朝上置于平皿中,用微解剖镊和双面刀片沿脊髓中央管纵切两半,再将脊髓两侧的腹侧部分切下,将组织块切碎, 用% 胰蛋白酶消化37℃30min分散后,用种植培养液同第二节稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培养箱中培养,24h后倾去培养皿内种植培养液, 改用饲养培养液同第二节进行培养;以后每周换液两次,每次更换50%的新鲜饲养培养液;2、胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元的生长分化和形态特征胚鼠和鸡胚脊髓腹侧神经元培养12h后,大部分神经元可贴壁,贴壁神经元呈圆形,直径5-8μm,其中少数神经元开始伸出1-2个突起;培养24h后, 神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络,培养的脊髓神经元以双极和多极为多见, 神经元呈圆形或椭圆形及多边形不等,胞核清楚,多数具1-2个核仁;随着培养时间延长, 神经元突起进一步增多、增粗并延长,形成稀疏的神经网络, 神经元胞体逐渐增大; 多极胞体大的神经元逐渐增多,经胆碱乙酰转移酶ChAT免疫组织化学染色和乙酰胆碱酯酶AChE组化染色呈阳性反应;此后,只要定期换液并适当抑制非神经细胞的过度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和鸡胚脊髓腹侧运动神经元在体外可维持培养2个月;五、新生大鼠海马神经元分散培养海马属大脑边缘系统,与情绪、学习及记忆有关,它具有明显的长突触传递的长时间程长时程增强LTP和长时程抑制LDT的能力;LTP和LDP具有协动性、特异性、长时性的特点,目前已被认为是学习和记忆的基础;而且海马组织常常是引起癫痫发作的病变部位,并且海马细胞对缺血、缺氧特别敏感;这些特征反映了海马神经元的内在性;例如,对缺氧的可塑性和易感性均与NMDAN-methyi-D-aspartate,N-甲基-D-天冬氨酸受体的独特性质相关;海马具有中枢神经系统的典型特性,有相对同源性的神经元群体,据估计,海马主要的细胞类型---锥体神经元占海马全部神经元的85%-90%;海马CA1和CA2区含有的锥体细胞在电生理特性及其相互连接的形式上各不相同,并能分别进行培养;海马锥体细胞具有特征性的形态,它们有单根轴突和数根树突组成,所有的树突都高度分化并密布树突嵴;此外,海马锥体神经元相互之间与中间神经元群体之间均有直接联系,在体外培养系统缺乏外源性传入纤维的情况下,海马神经元相互间仍然能产生广泛的突触联系;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧海马,用%胰蛋白酶消化36℃、30min分散后,用种植培养液同第二节稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞液, 接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置标本于36℃,含10%CO2的培养箱内培养;24 h 后顷去培养皿内种植培养液,改用饲养培养液同第二节培养;接种第5 d,在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5'-氟- 2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷3μg/ml以抑制非神经细胞的过度增殖, 作用48h 后更换新鲜培养液,以后每周换液2次,每次更换50%新鲜培养液;2、新生大鼠海马神经元的生长分化和形态特征新生大鼠海马神经元种植后12h,大部分细胞可贴壁,呈圆形, 其中少数神经细胞开始伸出1-2个突起;培养24h后,伸出突起的神经细胞逐渐增多, 突起一般为20-40μm,长者可达60μm;培养3d后, 神经元突起进一步增多并延长,形成稀疏的网络;培养的海马细胞以锥体细胞为多见,胞体较大,直径6-12μm;随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,胞突主干和分技明显延长并增粗,形成更加稠密的网络;海马神经元在体外可维持培养2个月;六、新生大鼠隔神经元分散培养隔亦属大脑边缘系统,主要与一系例内脏活动、躯体活动,情绪活动有密切关系;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧隔区,培养方法同海马神经元培养;2、新生大鼠隔神经元的生长分化和形态特征新生大鼠隔区培养神经元的生长分化基本上与新生大鼠海马神经元相似;但隔神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形, 直径6-8μm;随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,神经突起逐渐增粗, 并互相联络成网;新生大鼠隔神经元亦可持续培养2个月;七、新生大鼠下丘脑神经元分散培养下丘脑,作为神经系统和内分泌系统的连接点,在神经内分泌研究中有很重要的地位;它不仅通过神经-神经,神经—体液通路与垂体发生直接的联系,以兴奋与抑制两种不同的机制维持垂体内分泌的相对恒定,而且与脑干网状结构、皮质边缘系统等共同调节机体的各种活动;下丘脑的分泌功能以及其所分泌的各种肽类激素、神经多肽是下丘脑参与调节内脏活动、生理机能以及垂体内分泌的重要物质基础;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧下丘脑,培养方法同海马神经元培养;2、新生大鼠下丘脑神经元的生长分化和形态特征新生大鼠下丘脑神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠隔神经元相似;培养的下丘脑神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8μm,偶见胞体较大直径9-12μm的多极神经细胞;随着培养时间的延长, 下丘脑神经元胞体逐渐增大;下丘脑神经元亦可维持培养2个月;八、新生大鼠大脑皮层神经元分散培养大脑皮质是大脑半球最外表的一层灰质,大脑皮质内神经元的数量极大,其类型也很多,但均属多极神经元,神经元之间具有复杂的联系,反映皮质的高度发展;有人从机能上将皮质分为：感觉皮质、联络皮质、运动皮质;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧皮层,培养方法同海马神经元培养;2、新生大鼠大脑皮层神经元的生长分化和形态特征新生大鼠皮层元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠海马神经元相似;培养的皮层神经元中既可见到体积较大直径8-12μm的锥体细胞和颗粒细胞如星状细胞、篮状细胞和梭形细胞,也可见到马提诺蒂细胞,胞体较小,呈三角形或多角形;随着培养时间的延长, 神经元胞体逐渐增大,突起增粗;新生大鼠皮层神经元亦可持续培养2个月;九、新生大鼠纹状体神经元培养位于大脑皮质下,紧靠丘脑背外侧的几块灰质,称为基底神经节,它们包括尾状核、壳核和苍白球,前两者合起来又称为纹状体;纹状体是中枢神经系统的高级部位,在这里进行着运动机能的最高级整合,它们与随意运动的稳定、肌紧张和躯体运动的整合有密切关系;中脑黑质除含有较多的多巴胺DA神经元外,还含有γ-氨基丁酸GABA神经元等,纹状体是其主要的靶组织,共同组成黑质纹状体DA系统;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧纹状体,培养方法同海马神经元培养;2、新生大鼠纹状体神经元的生长分化和形态特征新生大鼠纹状体神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠隔神经元相似;培养的纹状体神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8μm;随着培养时间的延长, 纹状体神经元胞体逐渐增大;纹状体神经元亦可维持培养2个月;十、新生大鼠中脑黑质神经元培养黑质由中脑背侧的致密部和腹侧的网状部组成,中脑黑质是多巴胺神经元存在的部位,实验表明,大鼠中脑腹侧多巴胺在运动和行为中起着关键性的作用;黑质多巴胺能神经元退性病变可引起帕金森综合症;因此,多巴胺神经元的体外培养为多巴胺神经元的形态、受体分布、药物作用、电生理特性的研究以及多巴胺神经元移植研究提供了较好的实验手段;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧黑质,培养方法同海马神经元培养;2、新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠下丘脑神经元相似;培养的中脑黑质神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8μm,随着培养时间的延长, 中脑黑质神经元胞体逐渐增大;中脑黑质神经元亦可维持培养2个月;十一、新生大鼠小脑神经神经元培养小脑由外层的灰质皮质、内部的白质和三对深部的核团顶核、间位核和齿状核组成;与大脑皮质相比,小脑皮质的结构和神经元环路的组成相对简单,整个小脑皮质共有三层结构：分子层、浦肯野细胞层和颗粒层;其中含有五种神经元,即颗粒细胞,浦肯野细胞、篮状细胞、星形细胞和高尔基细胞;小脑是中枢神经系统中最大的运动机构,主要作用是维持躯体平衡,调节肌肉张力和协调随意运动;小脑的另一个与运动有关的重要功能是在技巧性运动的获得和建立过程中发挥运动学习的作用;在体外培养系统中,小脑细胞大小和形态的特征明显,容易识别;另外,小脑缺陷神经突变的小鼠种系比较多,这些条件都使小脑细胞成为发育研究的良好对象;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧小脑,培养方法同海马神经元培养;2、新生大鼠小脑神经细胞的生长分化和形态特征新生大鼠小脑神经元的生长分化基本和新生大鼠皮层神经元相似;培养的小脑神经元以颗粒细胞为多见,体积较小,直径3-5μm,亦可见到一定数量的星状细胞,哺肯野细胞和篮状细胞胞体直径6-8μm,它们均随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,突起逐渐增粗;新生大鼠小脑神经元亦可持续培养2个月;十二、新生大鼠脑腺垂体细胞培养大鼠的垂体分为前、中、后三叶,前叶亦称腺垂体,主要分泌生长激素、催乳素、各种促激素及黑素细胞刺激素;因此建立体外培养腺垂体细胞的方法,可用来探讨各种因素直接对细胞分泌功能的影响,以及开展神经内分泌分子生物学的研究;1、材料和方法取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下分离出腺垂体,用%胰蛋白酶消化36℃、30min分散后,用种植培养液同第二节稀释成2×106个细胞/ml密度的细胞液, 接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置标本于36℃,含10%CO2的培养箱内培养;24 h后顷去培养皿内种植培养液,改用饲养培养液同第二节培养;以后每周换液2次,每次更换50%新鲜培养液;2、新生大鼠脑腺垂体细胞的生长形态特征接种后24h,新生大鼠脑腺垂体分散细胞即开始贴附在胶元薄膜上生长,脑腺垂体细胞最初分散或聚集成小团,随后迅速分裂增殖;细胞境界清楚, 形状不规则,有圆形,卵圆或多角形;核位于胞体中央或偏于胞体一侧,可见1-2个核仁;随着培养时间的延长,脑腺垂体细胞胞体逐渐增大,形成单层, 铺满皿壁底层;脑腺垂体细胞可持续培养1个月;十三、神经胶质细胞培养一雪旺细胞雪旺细胞Schwann cell,SC是外周神经系统最主要的胶质细胞,也是外周神经的成髓鞘细胞；它形成髓鞘,或包裹轴突而不形成髓鞘;雪旺细胞的功能极其活跃,一旦神经受损,它能反应性分裂增殖,分泌神经营养因子,产生细胞外基质和细胞粘附分子,对神经元及其轴突起营养和修复作用;近年来的研究表明,雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复,如对脊髓的再生,对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等;说明雪旺细胞也能改善中枢神经再生的微环境,因而近年来对雪旺细胞的研究,尤其是体外培养研究已成热点;1、材料和方法雪旺细胞培养取材于各类哺乳动物的外周神经和背根神经节,取孵化8-12d鸡胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿,在无菌条件下用解剖镊分离出神经节,剥除神经节被膜, 用%胰蛋白酶消化37℃ 30min后用培养液 90% DMEM,10 % 胎牛血清,2mM谷氨酰胺吹打分散成细胞悬液,先接种于玻璃培养瓶中,于培养箱中孵育30 min后,翻转瓶子吸出细胞悬液,除去已贴壁的成纤维细胞,再接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中, 种植密度为×105个细胞/ml,每皿2ml细胞悬液置;置36℃、10%CO2培养箱中培养;接种第3 d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml,以进一步去除成纤维细胞, 作用48小时后更换新鲜培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液;2、雪旺细胞的生长和形态特征培养15d后可获得较高纯度的雪旺细胞,雪旺细胞呈双极梭状,核卵居中,相互平行排列,经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应;增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养,也可进行冷冻保存备用;二星形胶质细胞星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大,数量最多的一种,胞体呈星形,核大,呈卵圆形,染色质稀少,星形胶质细胞分两类,一类为原浆性星形胶质细胞protoplasmic astrocyte,其突起短粗,分枝多;另一种为纤维性星形胶质细胞fibrous astrocyte,它的突起细长,分枝少;纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞;星形胶质细胞具有多种功能,中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填,起结构的支持作用,星形胶质细胞的突起构成血脑屏障,星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等;调节局部神经递质的浓度,使神经网络能平稳地发挥作用;还能吸收细胞间隙中过多的K+,为K+的存储库,通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动;星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子,有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用,亦能分泌白细胞介素,肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子,星形胶质细胞有分裂能力,在中枢神经系统损伤后,星形胶质细胞增生、肥大,填补缺损,形成胶质瘢痕;1方法和结果选择出生 2 d 的SD大鼠,无菌条件下分离出大脑皮层,用%胰蛋白酶消化37℃ 30min后用培养液 90% DMEM,10 % 胎牛血清,2mM谷氨酰胺吹打分散成细胞悬液,先接种于玻璃培养瓶中,于培养箱中孵育30 min后,翻转瓶子吸出细胞悬液,除去已贴壁的成纤维细胞,再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2,每瓶10ml细胞悬液置;置36℃、10%CO2培养箱中培养;每周换液2 次,培养10-14h,细胞分为两层,下一层为I 型胶质细胞即原浆形胶质细胞,上一层是O-2A前体细胞,根据两类细胞贴壁能力的差异,以振荡培养技术进行分选,在37℃摇床上振荡,16 h180r/minO-2A前体细胞可被摇下来,摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中,培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A 前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞;可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养,也可进行冷冻保存备用;纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体GFAP染色确定;三少突胶质细胞1、方法和结果。
利用体外培养技术进行神经组织工程的步骤
利用体外培养技术进行神经组织工程的步骤体外培养技术是神经组织工程中的一项重要技术，它可以模拟体内环境，培养和维持神经组织的生长和发育。
下面将介绍利用体外培养技术进行神经组织工程的主要步骤。
第一步：细胞来源的选择在神经组织工程中，细胞来源是非常重要的。
常用的细胞来源包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）和成年组织的干细胞等。
胚胎干细胞和iPSCs具有较强的多向分化能力，可以分化为神经元和神经胶质细胞。
成年组织的干细胞则可以从体内获取，如脑组织和骨髓等。
第二步：细胞分化的诱导通过添加特定的生长因子和培养基成分，可以诱导细胞向神经细胞系列分化。
例如，添加神经营养因子（如神经营养因子-3和神经生长因子）可以促进神经元的生长和分化。
此外，还可以通过转染特定基因来诱导细胞分化为特定类型的神经元，如谷氨酸能神经元或多巴胺能神经元等。
第三步：细胞的扩增在细胞分化后，通常需要进行细胞的扩增，以获得足够数量的细胞用于组织工程。
细胞的扩增过程中需要注意细胞的稳定性和无菌操作，以保证细胞的纯度和活力。
第四步：三维组织工程的构建三维组织工程是神经组织工程的重要手段之一。
通过将细胞种植到具有特定结构和支架材料上，可以形成三维的组织结构。
常用的支架材料包括天然生物聚合物（如胶原和明胶）和人工合成聚合物（如聚乳酸和聚己内酯）。
这些支架材料不仅可以提供细胞黏附和生长的支持，还能够模拟体内组织的物理特性和生物化学信号。
第五步：生物反应器的使用为了模拟体内环境，通常需要使用生物反应器来提供适宜的气体、温度、pH 值和营养物质供给等条件。
生物反应器可以提供稳定的培养环境，并且可以调节培养条件以促进细胞生长和发育。
第六步：细胞的成熟和功能评估在组织工程过程中，细胞的成熟和功能评估是非常重要的。
通过检测细胞的形态、细胞间连接、细胞信号传导和相关基因表达等指标，可以评估细胞的成熟度和功能。
此外，还可以通过外界刺激（如电刺激、化学刺激）来检测细胞的响应能力和功能。
神经细胞的培养
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细胞培养的基本条件
超净工作台的使用
使用前： 开启柜内紫外灯照射10~30min； 预工作2~3min，以除去臭氧和使工 作台面、空间呈净化状态。 使用完毕后： 要用70%酒精将台面和台内擦拭干净。
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细胞培养的基本条件
火焰消毒
在无菌环境下培养时，首先要点燃酒精灯 ，以后的一切操作，如打开或封闭瓶口等 ，都需在火焰近处并经过烧灼。 注意事项：塑料和橡胶制品过火时要快速 ，不能长时间烧灼。
2.不能用手触及消毒器皿的工作部分， 工作台面上用品要布局合理 。 3.瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 4.吸溶液的吸管不能混用。 。
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细胞培养的基本概念
传代培养注意事项
5.接种数量一般为5x104~8x105个 /ml。
6.传代密度太低，细胞容易死亡，表现 出细胞在达到增殖前有较长的滞留期。 7.培养液由于pH下降呈黄色，若无污 染需要换液或传代。
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细胞培养的基本条件
细胞培养的实验用品
细胞培养瓶：25cm2，75cm2，150cm2
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细胞培养的基本条件
细胞培养板：6孔、12孔、24孔、48孔和96 孔（包括平底、U型和V型）。
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三、细胞培养的基本条件
无菌条件 细胞生长条件 细胞检测条件 细胞保存条件
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
神经干细胞再生与体外培养的实验研究
神经干细胞再生与体外培养的实验研究近年来，神经系统疾病已成为世界范围内重要的健康问题之一。
例如，阿尔茨海默病、帕金森氏症和脊髓损伤等疾病，对患者日常生活造成了严重的影响。
虽然目前有许多药物和治疗方法，但是很难完全治愈这些疾病，于是，神经干细胞再生的实验研究成为治愈神经系统疾病的一个新方向。
神经干细胞是一种具有自我更新和多线分化潜能的细胞。
这些干细胞能够分化成各种类型的神经细胞，包括神经元（神经细胞）和神经胶质细胞（支持细胞），并且有望重建损伤的神经组织。
具有自我更新潜力的神经干细胞可以通过细胞分裂不断产生更多的神经干细胞。
而分化潜力可以让神经干细胞，根据特定环境信号分化成一定类型的神经细胞。
在实验室中，神经干细胞的繁殖和分化可以通过体外培养来实现。
体外培养是指将细胞从其体内环境中分离出来，然后将其放置在好氧、无菌的环境中，加入一定的营养因子和细胞因子，提供良好的培养条件，使其生长、分裂，发挥其自我更新和多向分化的能力。
对于神经干细胞的体外培养，关键是要选择一种可以维持其自我更新和多向分化潜能的培养基。
目前，文化基础通常包括一种有机物，如人工合成物MS5和培养基B27，以及一种因子交联的蛋白质或培养基因治疗。
这些因子可以提供正确的信号和良好的环境，激活神经干细胞的分裂和分化。
另外，神经干细胞在培养时，还需要种植在一种支持细胞或未分化的神经细胞上，以提供必要的生长因子和支持。
在干细胞培养和分化的过程中，各种因素的运用互相协作，最终实现了神经干细胞的分化成为神经元和神经胶质细胞。
神经干细胞的再生研究，也可以辅助治疗神经系统疾病。
例如，通过研究神经干细胞在修复损伤后的体外和体内表现，社会上已经能够开发出一些神经干细胞的移植技术。
但是，目前这种技术的应用还面临一系列问题。
例如如何均等的种植神经干细胞、如何让其更好的定位和分化、如何减少免疫抑制剂和避免移植后的排异反应，以及如何克服治疗效果的耐受性等。
随着技术的进步，这些问题的解决将极大地推动神经干细胞和再生医学的发展。
神经细胞培养讲义课件
合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
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常用的平衡盐溶液（g/L）
R in g e r
PBS
(1 9 8 5 )
E a rg le (1 9 4 8 )
H anks (1 9 4 9
D u lb e c c o (1 9 5 4 )
b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃
b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4
c 渗透压：260~320m
mol/L
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3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！
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三、培养操作过程
• 新生1～3d SD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净
工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥 除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中
•剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消 化约20min，
Байду номын сангаас
•用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目 不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、 洗细胞两次，每次10min，
2 细胞系培养
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一 神经元的原代培养(Primary culture)
一、组织来源：
1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期
《神经培养技术》PPT课件
神经培养的发展历史
➢萌芽：1885年德国学者Roux将鸡胚的神经 板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内 存活数天。
➢起步：1907年，Harrison首次成功地用蛙 淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神 经细胞突起的生长过程。
➢发展：在设备、条件和方法上不断改进， 尤其是自二战结束后，进入了新的飞速发 展的阶段。
原代培养（primary culture）：神经细胞一 般不再分裂，不传代，故属原代培养。 再培养（sub-culture）：把培养物切、割、 取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。 联合培养（coculture）：把两种或两种以上 的组织放在一起进行培养。
四、其它
按开创研究者的名字命名，如Maximow 双盖片法。
《神经培养技术》PPT课 件
简介
体外培养（in vitro culture）包括：
组织培养（tissue culture） 细胞培养（cell culture） 器官培养（organ culture）
就是将活体结构成分（如活体组织、细 胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出， 放在类似于体内生存环境的体外环境中，让 其生长和发育的方法。
2. 生长附加成分 比较通用的： 胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺
（丁二胺） B-27、N-2（Gibco）
全培液
以下各种成分各10 ml配制成全配 液40 ml（葡萄糖含量为6g/L）： 1. 胎牛血清 2. DMEM 3. 九天鸡胚渗出液 4. Glucose/BSS（5%葡萄糖溶液 4.7 ml， Tyrode’s BSS 5.3 ml）
低限量 Eagle培养基
DMEM：Dulbecco’s Modified Eagle Medium
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经细胞培养讲义
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
缺点：1）仅能获得Ⅰ型胶质细胞
2） 成纤维细胞增殖能力更强 3）部分Ⅰ型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获 得
3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好
污染细胞的去除
1 成纤维细胞的污染：为Ⅰ型星型胶质细胞主要污染细 胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别） 1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，
• 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解
乳蛋白） 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
原始数据图，颜色表示荧光强度
Neuroblastoma cells on silicon wafer
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数）
b 悬浮生长型细胞（少数）
2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
ppt课件
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实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
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实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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☞ 主要内容 :
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实验原理