三种原代大鼠肝细胞分离方法的比较
原代大鼠肝细胞分离与纯化方法
ｉ ｒｖｄｆ ｍ （ ８３ ｍｐｏｅ ｏ ｒ ４ ．８±６９ ） ％ ｔ （ ２６ ．７ ｏ ９ ．３±２５ ） ％ （ ．０ Ｐ＜００ ）， ａ ｄ ｔｅｐ ｒｙｗ ｓｏｅ ５ ，ａｔ ．１ ｎ ｕｉ ａ ｖｒ９ ％ ｈ ｔ ｆｒ ｅ
ａ ｐｙｎ ｉ ｏ ｔ ｕ ｕ ｒ ｄｅ ｔｅ ｎｒ ｕ ａｉｎ ｍｅｈ ｄ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｔ ｉ ｎ ｗ ｍｅｈ ｄ ｉ ａｐ ｒ ｃ ｃ ｎｑ ｅ ｐ ｌｉｇａｄｓ ｎ ｉ ｏ ｓｇａ ｉｎ ｅ ｔ ｆｇ ｔ ｔｏ ． ｃ ｎ ｉ ｏ ｎ ｌｓｏ ｓ ｈｓ ｅ ｔｏ ｓ ｅ ｅ ｔ ｅ ｈ ｉｕ ｆ ｔ
浙 江 宁波 ３５１ １ ０ ０）
对传
武 ，
（） 昆明 医学 院第一 附属 医院感染科 ，云 南 昆明 ６０ ３ ； ２） 宁波 市传 染病 医院 ， １ ５０２
［ 摘要］ 目的 探讨改 良 、简化肝 细胞 的灌 注 、分离方法 ，以提高 细胞产量 ，降低制作成 本． 方法
活率 ，并与 Ｐ ｒｏ 梯度离心纯化法进行 比较．结果 ｅｃｌ ｌ
ｃ ｎ ｒｆ ａ ｉｎ ｅ ｔｉ ｕｇ ｔ ｍｅｈ ｄ ｏ ｔ ｏ ｗａ ａ ｌ ｄ ｏ ｕｒｆ ｔ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｓ Ｔｈ ｈ ｐａｏ ｙｅ ｉｌ ｓ ｎｄ ｉ ｂ ｌ ｉ ｓ ｓ ｐｐｉ ｔ ｐ ｉｙ ｈ ｈ ｐａｏ ｙ ｅ ． ｅ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｙｅ ｄ ａ ｖａ ｉｉ ｅ ｗｅ ｅ ｔ ｒ
ｍｅ ｓ ｒｄ Ｒｅ ｕｔ Ｔ ｅｖａ ｉｔ ｆ ｅ ａｏ ｙｅ ｂａｎ ｄｂ ｈ — ｔｐ ｐ ｒ ｓｏ ｉ ｏｌｇ ｎ ｓ ｉ ｓ ａｕｅ ． ｓｌ ｓ ｈ ｉｂｌｙｏ ｐ ｔｃ ｔｓｏ ｔｉｅ ｙｔｅｔ — ｅ ｅｆ ｉｎ ｗ ｔ ｃ ｌ ｅ ａｅｉ ｓ ｕｗａ ｉ ｈ ｗｏ ｓ ｕ ｈ ａ ｎ ｔ
高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养
第16卷 第11期 2003年11月医学研究生学报Journal of Medical PostgraduatesVol.16 No.11Nov.2003・论 著・高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养Ξ王新颖, 李维勤, 李 宁, 黎介寿(南京军区南京总医院解放军普通外科研究所,江苏南京210002)摘要: 目的:分离及培养高纯度的原代大鼠肝细胞。
方法:用含EGTA的D2Hanks液及含DNaseⅠ的胶原酶消化液分两步原位灌注大鼠肝脏,分离细胞经3次低速离心(50g,5min)后获得纯化的肝细胞。
肝细胞存活率检测用锥虫蓝拒染法,纯度检测用苏木精2伊红染色。
采用加入特殊营养成分的RPMI1640培养液培养,用倒置相差显微镜观察细胞活力。
结果:每只180～200g的大鼠平均可获(1.0～1.5)×108的细胞,存活率>50%,纯度高于98%。
培养1、3、5天肝细胞的存活率分别为100%、94.5%、89.5%,形态良好。
结论:改良原位灌注消化法分离肝细胞产率较高,活性较好,加入特殊营养成分的RPMI1640培养液培养能保持肝细胞良好的形态。
关键词: 肝细胞; 分离; 培养; 大鼠中图分类号: Q813.11 文献标识码: A 文章编号: 100828199(2003)1120822203Separation and culture of high2purity primary rat hepatocyteWAN G Xin2ying,L I Wei2qin,L I Ning,L I Jie2shou(Research Instit ute of General S urgery,N anji ng General Hospital of N anji ng Com m and,N anji ng 210002,Jiangsu,Chi na)Abstract: Objectives:To establish a method of separation and culture of high2purity primary rat hepatocyte. Met hods:The perfusion solutions used in the first and the second step were D2Hank’s solution containing EGTA,and the digestive solution contained DNase I and collagenase respectively.Purified hepatocytes were separated from the dissociative cells by low2speed centrifugation(50g,5 min)3times.The survival rate was measured by typan blue exclusion and the purity was measured by routine hematoxylin and2eosin cytochemistry.Separated hepatocytes were cultured in RPM I1640cul2 ture medium with some special nutrient elements.Throughout the i n vit ro culture,we kept continu2 ous observation of the shape changes of the hepatocyte and measured the survival rate within the first5 days. Results:(1.0～1.5)×108cells were prepared from a180-200g rat on average,the survival rate was higher than50%and the hepatocyte purity was higher than98%.Microscopically,the hepa2 tocytes were normal in shape and viability. Conclusions:The modified in situ perfusion digestion method and the culture in RPM I1640and special nutrients are advantageous to get high viability and purity hepatocyte with normal shape.K ey w ords: Hepatocyte; Separation; Culture; Rat0 引 言体外培养的大鼠原代肝细胞是研究毒理学、药理学、生物化学及致癌作用的有效手段,同时也是研究感染状况下肝急性相反应良好的体外模型[1～2]。
原代大鼠肝细胞的分离和培养_蒋永生
中华中医药学刊原代大鼠肝细胞的分离和培养蒋永生1，程向东2，刘文洪1，项海1，姚立1（1．浙江中医药大学，浙江杭州310053；2．浙江省肿瘤医院，浙江杭州310022）摘要：目的:探讨原代大鼠肝细胞分离及培养的简易方法，建立稳定简便的大鼠原代肝细胞分离培养方法。
方法:采用改良原位两步循环灌流法及低速离心法分离原代大鼠肝细胞，常规DMEM :高糖培养基培养原代大鼠肝细胞，测定1周内生长情况，倒置显微镜及扫描电镜观察肝细胞形态变化。
结果:倒置显微镜下观察肝细胞在接种后3h 基本完成贴壁，贴壁的细胞呈卵圆形，24h 后胞体变大变平，随后细胞相互靠拢呈岛状或条索状连接，3d 后扫描电镜下细胞呈现良好形态。
结论:用改良原位两步循环灌注法及低速离心法成功分离并培养原代大鼠肝细胞，可操作性强，可在具备基本细胞培养条件的实验室推广。
关键词：大鼠;原代肝细胞;分离;培养中图分类号：R －332文献标志码：A 文章编号：1673－7717(2013)05－1111－02Isolation and Culture of Primary Rats HepatocytesJIANG Yongsheng 1，CHENG Xiangdong 2，LIU Wenhong 1，XIANG Hai 1，YAO Li 1（1．Zhejiang Chinese Medical University ，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ；2．Zhejiang Cancer Hospital ，Hangzhou 310022，Zhejiang ，China ）Abstract ：Objective ：To investigate a simple and feasible method for primary rats hepatocytes isolation and culture ，and to establish a stable and easy methods of isolation and culture of primary rats hepatocytes．Methods ：Hepatocytes were isolated by using a modified two －step in －situ －circulating perfusion method followed by low －speed centrifugation．The hepatocytes were cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium with high level of glucose．The viabilities of cells were evaluated within one week．Cellular morphological changes were observed by using an inverted microscope and scanning electron microscope （SEM ）．Results ：The elementary adherence completion of the hepatic cells had been posted inoculation after 3h under inverted microscope ，the cells of adherence offerred ovate．The hepatocytes enlarged and flattened round ，attached to the surface of collagen －coated dishes 24h after seeding and then connected with surrounding cells ，forming islands or trabs．After 3days ，cells were well under the SEM．Conclusions ：Primary rats hepatocytes can be successfully i-solated and cultured using a modified two －step in －situ －circulating perfusion method ，which is highly feasible．This method is available to perform in labs with basic cell culture conditions．Key words ：rat ；hepatocytes ；isolation ；culture 收稿日期：2012－12－20基金项目：浙江省钱江人才计划资助项目（Q1770802006）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2101290）作者简介：蒋永生（1987－），男，硕士研究生，研究方向：中药治疗心脑血管研究。
大鼠肝细胞原代分离培养方法
大鼠肝细胞原代分离培养方法
（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。
打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。
剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。
（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。
（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。
用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。
（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。
（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。
后续隔天换液培养。
大鼠肝细胞与kupffer细胞的分离与鉴定
大鼠肝细胞与kupffer 细胞的分离与鉴定李婉雁1，2，相雪莲1，2，曹楠1，2，陈文斌1，2，潘建秋1，2，江丹莉1，2，田允波1，2，黄运茂1，2，许丹宁1，2*（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州510225）摘要：本研究旨在建立一种简单有效的分离大鼠肝细胞和kupffer 细胞的方法。
大鼠体外肝脏灌流，采用percoll 密度梯度分离法分离肝细胞与kupffer 细胞，糖原染色鉴定肝细胞，墨汁吞噬实验鉴定kupffer 细胞。
结果表明，此方法分离的肝细胞和kupffer 细胞活性都在95%以上，新分离的肝细胞鹅卵石样，贴壁能力不是特别强，24h 可分化出不同形态。
Kupffer 细胞具有较强的吞噬能力和贴壁能力，可看到墨汁被细胞吞噬。
结论：本实验建立的分离培养方法较稳定，为开展肝细胞和kuffer 细胞的相关研究提供方法依据，也为建立各种体外细胞分离培养方法提供借鉴。
关键词：大鼠；肝细胞；kupffer 细胞；分离；鉴定中图分类号：Q343.6文献标识码：B文章编码：1005⁃8567（2021）02⁃0046⁃04收稿日期：2021⁃03⁃16基金项目：广东省基础与应用基础研究基金项目区域联合基金⁃青年基金项目（2019A1515110106）作者简介：李婉雁（1988⁃），女，广东广州人，讲师，博士。
*通讯作者：许丹宁，E⁃mail ：*****************肝脏是机体最大的代谢器官，在机体的生命活动中扮演着相当重要角色，很多疾病的防治和肝脏的代谢息息相关［1］。
作为体外培养的一种原代细胞，肝细胞具有很强的活性和高代谢能力，在研究肝脏的代谢机制以及药物对肝脏的作用机制方面具有十分重要的作用，为研究药物代谢、开发新药物的研究提供了一个有效平台。
因此，建立有效稳定的分离和培养原代肝细胞方法，将为开展肝脏功能相关研究提供有力的方法支持［2，3］。
鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。
[操作步骤]1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。
立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。
加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。
37℃5％C02孵箱内消化30分钟；6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;7.4℃800g平抛离心30分钟。
吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。
24小时后换液，此后每3天换液1次。
方法二：[动物]雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。
[操作步骤]1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色；3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)；7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天换液1次。
原代大鼠肝细胞分离培养方法改良_张义冉
的基础上逐步改 善 并 建 立 了 胰 酶 二 步 灌 流 法 ， 从而 寻求到一种高效 、 经济的分离 、 培养原代大鼠肝细胞 的方法 。
１ 材料与方法
购自江苏大 １． １ 实验动物 ６ 周 龄 雄 性 Ｓ Ｄ 大 鼠， 。 学实验动物中心 ， 清洁级 ， 体质量 １ ８ ０～２ ０ ０ｇ ； １． ２ 主 要 试 剂 胰 酶 （ Ａｍ ｒ ｅ ｓ ｃ ｏ） Ｗ ｉ ｌ ｌ ｉ ａ ｍ ｓ Ｍ ｅ ｄ ｉ － 培养基 、 青霉素 、 链霉素 、 胰 岛 素、 地塞 ｕ ｍ Ｅ（ ＷＭＥ） ） ； （ ； 米松 （ 胎牛血清（ 冰乙酸 Ｓ ｉ ｍ ａ Ｆ Ｂ Ｓ） Ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ） ｇ （ 。 国药集团化学试剂有限公司 ） 苏州净化设备有限公 １． ３ 主要器材 超净工作台 （ ； ） ； 司） 美国 Ｔ 恒温水浴锅（ 上海 Ｃ Ｏ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ２ 培养箱 （ ； 精宏实验设备有限公司 ） 常州 Ｂ Ｔ ０ ０ １ ０ ０ Ｍ 蠕动泵（ － ； ） ； 科健蠕动泵厂 ） 日本 Ｎ 离 ８ ０ ｉ型荧光显微镜 （ ｉ ｋ ｏ ｎ 。 心机 （ 北京雷勃尔离心机有限公司 ） １． ４ 鼠 尾 胶 原 的 制 备 将 成 年 Ｓ Ｄ 大鼠鼠尾洗净 后剥去皮毛 ， 抽 出 尾 腱 置 于 平 皿 中， 用７ ５％ 的 酒 精 浸泡 ３ 然后用生理盐水将酒精冲洗 ５ 遍以上 ， ０ｍ ｉ ｎ；
［ ６］
收稿日期 ： ２ ０ １ ２ ０ ６ ２ ６ － － ） 基金项目 ： 国家自然科学基金资助项目 （ ３ １ １ ０ １ ８ ６ ６， ３ ０ ９ ７ ２ ２ ２ ９ ， 作者简介 ： 张义冉 （ 女， 博士研究生 。 １ ９ ８ ２ －） ： Ｅ－ｍ ａ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｚ ｏ ｎ ｉ ｎ ｚ ｕ． ｅ ｄ ｕ． ｃ ｎ ＊ 通讯作者 ， ＠ｙ ｇ ｐ ｇ
原代肝细胞
原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。
该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。
但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。
1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。
该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。
但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。
可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。
2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。
胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。
原代肝细胞分离方法
原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1.1.1 机械分离法:机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.1.1.2 胰酶消化法:胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3 胶原酶消化法:胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.1.2.1 离体胶原酶灌流法:离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。
大鼠原代肝细胞分离培养方法的改良
大鼠原代肝细胞分离培养方法的改良裔传卉;汪纪仓;刘宗平【摘要】本研究的目的是改进经典的Seglen原位两步胶原酶灌流法,建立稳定简便的大鼠原代肝细胞分离培养方法.采用胰酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养,过碘酸-雪夫反应(PAS)鉴定.结果显示,本法培养的肝细胞产量高、活力好,每只大鼠可获得约2×10~8个肝细胞;相差显微镜观察不同生长期的肝细胞,细胞贴壁后变平变薄,双核细胞呈岛状连接的形态学特性;PAS鉴定,肝细胞内由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色.表明改良的方法稳定、高效,为进一步的试验研究奠定了基础.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2009(000)005【总页数】3页(P201-203)【关键词】肝细胞;细胞培养技术;PAS;分离【作者】裔传卉;汪纪仓;刘宗平【作者单位】扬州大学兽医学院,江苏扬州,225009;扬州大学兽医学院,江苏扬州,225009;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳,471003;扬州大学兽医学院,江苏扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852体外肝细胞培养模型具有突出的优点，能接近生理状态研究药物和毒物的代谢及毒性，真实反映体内的代谢情况，排除体内其他因素的影响[1]。
随着技术水平的不断提高，原代肝细胞培养越来越成熟，并广泛地用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究，被称为体外药物试验的“金标准”[2]。
但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功，故在一定程度上限制了肝细胞离体模型的广泛应用[3]。
Seglen的原位两步胶原酶灌流法分离培养的肝细胞不仅数量多、纯度高、形态好，而且还保留肝细胞的功能，是分离培养大鼠原代肝细胞的经典方法[4]。
但胶原酶法灌流装置昂贵，成本费用高，操作复杂，限制了该方法的广泛应用。
本研究对该经典方法进行了改良，建立了操作简便、成本低廉、不需要复杂设备的大鼠原代肝细胞培养模型。
1 材料与方法1.1 材料SD大鼠：180～220 g，雄性，清洁级，扬州大学医学院实验动物中心提供。
原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究
原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究
胡聪;韩聚强;修贺明;徐铮;郝晓东
【期刊名称】《河北医科大学学报》
【年(卷),期】2000(021)004
【摘要】目的探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法.方法以Wistar大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并进行原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相差倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量.结果直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强.结论经胶原酶消化分离获取肝细胞的方法优于直接分离法.
【总页数】3页(P199-201)
【作者】胡聪;韩聚强;修贺明;徐铮;郝晓东
【作者单位】中国人民解放军石家庄白求恩军医学院,石家庄,050081;河北医科大学公共卫生学院流行病学教研室;中国人民解放军白求恩国际和平医院,石家
庄,050081;中国人民解放军白求恩国际和平医院,石家庄,050081;中国人民解放军白求恩国际和平医院,石家庄,050081
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法 [J], 刘学忠;李慧敏;王富民;顾建红;刘宗平
2.原代培养大鼠肝细胞分离方法比较研究 [J], 唐智敏;杨玲;等
3.大鼠肝细胞的分离及BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的影响 [J], 张娓;张东铭;张苏河;张钦宪
4.肝脏灌注分离大鼠肝细胞及原代培养的方法 [J], 夏志强;董晨
5.改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究 [J], 庄鹏;李志莹;范紫香;江元森;姚集鲁
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原代肝细胞分离
肝细胞原代培养
实验用品
1.仪器与用品：倒置相差显微镜显微镜，离心机，试管，移液枪，培养皿，手术刀片，注
射器，眼科剪，真空泵
2.试剂：DMEM高糖细胞培养液（Hyclone），PBS（自配），0.25%胰酶（碧云天）
3.材料：成年大鼠（军事医学科学院动物房）
实验步骤
1. 按照约50g/kg大鼠为大鼠注射麻醉剂,待其昏迷后，置75%酒精中浸泡3min，剖取大鼠肝脏，置于玻璃皿中，分成小块，剔除脂肪、结缔组织等杂物。
2. 取1ml PBS于培养皿中清洗肝脏组织，洗完后吸去PBS，然后再用1ml PBS清洗一次。
3. 用眼科剪刀反复剪碎肝组织，直至剪成1mm3大小的组织块
4. 加入2ml胰酶消化，放于37℃培养箱中20min。
消化十分钟时拿出来摇晃一次。
5. 镜检，待细胞从组织解离。
将消化液全部转入10ml离心管中，再加入1ml培养基终止胰酶消化，在2000 rpm下离心3 min
6. 离心后，用枪吸去上清，加入3 ml培养基重新悬浮，静置。
7. 静置后，吸出上清至另一10 ml离心管中，在2000 rpm下再离心3 min
8. 弃去上清，小心收集离心管底细胞，加入5 ml新鲜培养基重新悬浮，接种到新培养皿中，标记后，放于37℃培养箱中培养。
实验结果
大鼠原代肝细胞
1。
大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞的同步分离与培养
大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞的同步分离与培养李洋;蔡双明;张莉莉;李旭【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)004【摘要】Objective To establish a method for simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Methods By combining in situ perfusion, in vitro perfusion, density gradient centrifugation and differential adhension, primary rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells were obtained. The purity of these cells were assessed with morphological observation, immunofluorescent staining and ink phagocytosis assay. Results We successfully obtained the 4 primary cells simultaneously by combining in situ perfusion with in vitro perfusion, density gradient centrifugation, and differential attachment. The cell yield rate, cell viability and purity all met requirements for the subsequent cell experiment. Conclusion The combined cell isolation and culture method is feasible to isolate primary rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells simultaneously.%目的：探索和建立同步分离大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞，并进一步鉴定和培养的方法。
原代肝细胞分离方法
原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1.1.1 机械分离法:机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.1.1.2 胰酶消化法:胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3 胶原酶消化法:胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.1.2.1 离体胶原酶灌流法:离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。
原代培养鼠肝细胞分离和培养的改良方法初探
原代培养鼠肝细胞分离和培养的改良方法初探
曹健美
【期刊名称】《深圳中西医结合杂志》
【年(卷),期】2004(14)1
【摘要】目的探索一种简捷、高效的鼠肝细胞分离和培养方法。
方法在传统的原位胶原酶灌注分离鼠肝细胞方法的基础上稍加改良,并从产量、活率、形态观察等方面加以说明。
结果改良后的胶原酶法无论在产量或形态、活力方面均优于传统的胶原酶法。
结论改进后的肝细胞分离和培养方法为一较为完善、简捷的方法。
【总页数】3页(P8-10)
【关键词】肝细胞;胶原酶法;分离和培养
【作者】曹健美
【作者单位】上海中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R-332
【相关文献】
1.大鼠原代肝细胞分离培养方法的改良 [J], 裔传卉;汪纪仓;刘宗平
2.一种改良大鼠肝细胞分离和原代培养技术 [J], 王伟雅;周济宏;张峰;平晓春;李幼生;黎介寿
3.一种改良的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法 [J], 唐雪;马海田
4.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李
鹏云;文静;陈琳琳;杨艳
5.改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究 [J], 庄鹏;李志莹;范紫香;江元森;姚集鲁
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收稿日期:2009-01-08作者简介:张丽芳(1981-),女,硕士研究生,主要从事药物代谢动力学的研究。
通信作者:胡晓(1963-),女,教授,硕士生导师,从事临床药理学的教学和科研,E -mail:hux iao 1185@126.co m 。
三种原代大鼠肝细胞分离方法的比较张丽芳a ,王 萍b ,胡 晓b(南昌大学a.研究生院医学部2005级; b.医学院临床药理研究所,南昌330006)摘要:目的 寻求一种高效、价廉的原代大鼠肝细胞分离方法。
方法 采用组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法对大鼠原代肝细胞进行分离。
比较3种方法所获得的肝细胞的产率、存活率、纯度及胶原酶的用量。
结果 组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法所获得大鼠原代肝细胞的产量分别(0.21?0.11)、(1.87?0.51)、(1.94?0.55)@108/只大鼠;存活率分别为(54.34?8.21)%、(85.18? 4.90)%、(90.34?4.46)%;肝细胞纯度分别为(68.80?10.30)%、(85.12?2.87)%、(91.84?30.3)%;胶原酶用量分别为(17.38?2.13)、(78.75?20.83)、(31.2?12.46)mg /只大鼠。
结论 相比于组织块法和胶原酶原位灌流法,胶原酶二步灌流法为一种经济、高效的原代大鼠肝细胞分离方法。
关键词:原代大鼠肝细胞分离;组织块法;胶原酶原位灌流法;改良二步胶原酶灌流法;动物,实验;大鼠中图分类号:R-332 文献标识码:A 文章编号:1000-2294(2009)05-0040-04Comparison of Three Primary Rat Hepatocytes Isolation MethodsZHANG L-i fang a ,WANG Ping b ,HU Xiao b(a .2005G rade of M edical Dep artment of Gr aduate School;b .I nstitute of Clinical Phar macology of Medical Colleg e,N anchang Univer sity ,N anchang 330006,China)ABSTRAC T:Objective To search an econom ical isolatio n method w ith hig h efficiency for rat hepatocyte iso lation through com parison of thr ee isolation metho ds.Methods Tissue,collag e -nase perfusion in situ,and the im pro ved collag enase perfusio n iso lation method w ere respectiv ely em plo yed,and the co mparison of cell y ield,survival r ate,purity and the co nsum ed amount of co-l lag enase w as respectiv ely m ade.Results In sequence o f issue,co llagenase per fusion in situ,and the improv ed collagenase perfusion isolation m ethod,the hepatocyte .s y ield per rat w as respec -tively (0.21?0.11),(1.87?0.51)and (1.94?0.55)@108;sur vival ratio w as respectively(54.34?8.21)%,(85.18?4.90)%and (90.34?4.46)%;the purity w as respectively (68.80?10.30)%,(85.12?2.87)%,and (91.84?30.3)%;the consum ed am ount of collag enase w as re -spectively (17.38?2.13),(78.75?20.83)and (31.2?12.46)mg.C onclusion T he improv ed collag enase per fusion iso lation method is a economical o ne w ith high efficiency for r at hepatocy tes com pared to tissue and co llagenase perfusio n in situ metho d.KEY WORDS:isolation primary rat hepatocyte;tissue isolation;collegenase perfusion in situ;improved collagenase perfusion isolation;animals,laboratory;rats原代肝细胞作为研究药物体外代谢机制的一种重要工具,一定时间内保持了成熟肝细胞的功能,具有高活性与高代谢能力,被广泛用于药物代谢及药物间相互作用等领域的研究。
目前,原代肝细胞分离提取方法虽然很多,但由于制备技术复杂及试验过程中操作标准的差异,原代肝细胞的活性有较大差异,直按影响了试验结果的客观性。
本文比较了组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法三种肝细胞的分离方法,且在此基础上,通过考察肝细胞的形态学、生长等指标,对胶原酶原位灌流法进行了改进,建立了一种经济、高效的低浓度胶原酶二步灌流法。
1材料和方法1.1材料1)试验动物:SD大鼠,雄性,体质量(200?20)g,由南昌大学医学院动物科学部提供。
2)主要试剂:Ô型胶原酶、EDTA、胰岛素、转铁蛋白、台盼蓝、M TT、鼠尾胶原均购自美国Sigma 公司;L-谷氨酰胺、H EPES均购自美国Am resco公司;DMEM购自美国Gibco公司;胎牛血清由杭州四季青生物制品有限公司提供。
1.2方法1.2.1溶液的制备0.02%无钙EDTA-PBS液制备:0.1g EDTA 溶解于500mL PBS液中,调pH值约为7.65,高压灭菌,4e保存备用。
0.025%Ô型胶原酶灌流液制备:25mgÔ型胶原酶,56.5m g CaCl2,H EPES 1.19g,溶于100mL无菌蒸馏水,调pH值约为7.65,经0.22L m微孔滤膜过滤除菌,于4e保存备用。
肝细胞洗涤液制备:DMEM培养液,青霉素100U/mL,链霉素100U/m L溶于无菌蒸馏水,经0.22L m微孔滤膜过滤除菌,于4e保存备用。
细胞培养液:DMEM培养液,青霉素100U/mL,链霉素100U/mL,L-谷氨酰胺0.3g/L,氢化可的松1L m ol/L,转铁蛋白5L g/mL,100L g/L胰高血糖素,胰岛素0.16U/mL,胎牛血清10%, 25mmo l/L H EPES,经0.22L m微孔滤膜过滤除菌,于4e保存备用。
1.2.2大鼠肝细胞的分离组织块法:按参考文献[1-2],5%戊巴比妥钠麻醉SD大鼠,腹部备皮消毒,打开腹部,分离出肝脏于无菌培养皿中,用4e PBS液洗净血污,剥除被膜和血管纤维,并剪碎肝脏为1~3m m3组织块,再用4e0.02%无钙EDT A-PBS液反复洗涤,加入0.025%Ô型胶原酶液于4e冰箱消化过夜。
将消化悬液经200目不锈钢网筛过滤,所得肝细胞用4e DM EM洗涤液洗涤,低速离心(600r/min, 5min)重复3次,最后用细胞培养液接种于培养瓶内培养。
胶原酶原位灌流法:采用Seglen原位两步灌流法对肝细胞进行分离[3]。
5%戊巴比妥钠麻醉SD 大鼠,肝素钠抗凝,常规腹部备皮消毒,开腹,门静脉插管固定,开放下腔静脉,用37e0.02%无钙ED-TA-PBS液灌流,30mL/m in,10m in除去肝脏内的血液,随之用37e0.025%Ô型胶原酶液灌流约300m L(20m L/min)至肝脏变软,分离肝脏,撕开肝包膜,将肝细胞收集到4e DMEM洗涤液,经200目不锈钢网筛过滤,静置,低速离心(600r/min,5m in)重复3次,用细胞培养液接种于培养瓶内培养。
改良二步胶原酶灌流法:参考相关文献[4-6], 5%戊巴比妥钠麻醉SD大鼠,尾静脉注射肝素钠抗凝,腹部备皮消毒,开腹,门静脉插管固定,开放下腔静脉,用37e0.02%无钙EDT A-PBS液灌流, 30mL/m in,10m in除去肝脏内的血液,将肝脏小心分离到无菌培养皿中,再用37e0.025%Ô型胶原酶液循环灌流,20mL/m in,约10min。
当肝包膜下肝组织呈龟背裂隙时停止灌流,将肝细胞小心地刮梳到4e DM EM洗涤液,经200目不锈钢网筛过滤,静置,重复低速离心(600r/min,5m in),最后用细胞培养液培养。
1.2.3肝细胞形态学观察肝细胞进行常规的H E染色,用倒置相差显微镜观察新鲜分离的大鼠肝细胞形态并摄影。
1.2.4细胞产量、纯度及活率的测定将分离所得的大鼠肝细胞用0.4%台盼蓝染色和H E染色,在显微镜下计算3种方法所获得的肝细胞的产率、纯度及活率。
1.2.5MT T法检测各组肝细胞的活力将3种方法分离得到的肝细胞在铺有鼠尾胶原的96孔板上培养6d(接种密度为1@105/mL),每天读取8孔,加入M T T液(5mg/mL)20L L,37e 继续孵育4h,吸弃孔内培养上清液,每孔加入150L L的DM SO,在波长490nm的酶联免疫检测仪上测定各孔OD值。
1.2.6统计学方法计量资料以x?s表示,采用DAS1.0统计软件对数据进行t检验和方差分析,P<0.05表明有显著性统计学差异。
2结果2.1肝细胞形态学倒置相差显微镜观察新鲜分离的大鼠肝细胞形态,可见肝细胞形态大小均一,细胞透亮,呈圆球形,随着培养时间的延长,可见肝细胞贴附,伸展,变薄呈椭圆形或多边形,边界轮廓清晰,胞浆丰富,胞浆内有许多小颗粒,细胞核位于正中,可见大量双核细胞。
细胞排列整齐,紧紧黏附于培养瓶底,相互融合成片状、岛状(图1),细胞可在体外培养达3周。
电镜下肝细胞培养24h的图像(H E染色)电镜下肝细胞培养4h的图像(H E染色)图1肝细胞形态学2.23种方法胶原酶的用量,肝细胞的产量、纯度及活率的比较试验中,作者采用3种方法对大鼠肝细胞进行分离,其中肝细胞组织块法所获得的肝细胞的产量和活率均显著低于胶原酶灌流法,改良的二步胶原酶灌流法取得的肝细胞的纯度,产量,活率与原位灌流法进行比较,有所提高,特别是胶原酶的用量要明显减少,节约了胶原酶的用量(表1)。