02菌种扩大培养
第二章、菌种的扩大培养2010
实例
放线菌(抗生素生产) 放线菌的细胞生长繁殖速度较慢， 放线菌(抗生素生产)：放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常 常用三级种子扩大培养， 常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中， 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵， 50t发酵罐多采用三级发酵 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级 发酵，如链霉素生产。 发酵，如链霉素生产。 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 ）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 细菌(谷氨酸)：谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 细菌(谷氨酸) 谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。
第二节、 第二节、种子扩大培养
扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料，提供相当 扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料， 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子扩大培养流程如下： 种子扩大培养流程如下： 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 ---一级种子摇床培养------发酵罐 发酵罐。 养----发酵罐。
接种量的确定
大量地接入成熟的菌种， 大量地接入成熟的菌种，可以缩短生长过程的缓慢 因而缩短发酵周期， 期，因而缩短发酵周期，节约了发酵培养的动力消 提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 耗，提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 接种量过多也无必要，因种子培养费时， 接种量过多也无必要，因种子培养费时，而且过多 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 接种量与菌种的生长速度有关， 接种量与菌种的生长速度有关，如霉菌接种量一般 10%，酵母5 10%，细菌1 5%。 为10%，酵母5-10%，细菌1-5%。 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量可明高的营养缺陷型突 根据代谢控制的要求， 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 菌种纯粹，不易变异退化， 菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品 质量的稳定性； 质量的稳定性； 不是病源菌， 不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒 包括抗生素、激素和毒素等) 以保证安全。 素(包括抗生素、激素和毒素等)，以保证安全。
二章节菌种及其扩大培养4学时-PPT精选
➢ 短期、过渡的保藏方法 ➢ 新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生
长丰满后，放在4°C冰箱保存。 ➢ 一般保存期为三个月到六个月。
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第二章 菌种扩 大培养
沙土管保藏法（缺营养、低温）
适合于产孢子或芽孢的微生物。制备方法： ① 将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为1—2：
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产 用种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。
种子液质量的优劣 对发酵生产起着关键性的作用
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第二章 菌种扩 大培养
种子扩大培养 – 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养 而获得一定数量和质量的纯种。这些纯 种培养物称为种子。
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第二章 菌种扩 大培养
菌种保藏的意义
菌种 –微生物学以及生命科学研究的基本材料 –世代时期很短，传代过程中易发生变异、死亡 –造成工业生产菌种的退化、使优良菌种丢失。
菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要 组成部分
要采用最合适的保存方法使菌种的变异和死亡减少 到最低限度
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第二章 菌种扩 大培养
1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左 右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。 一般沙用80目过滤，土用80一100目过筛。 ② 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢 子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干， 放在冰箱内保存。一般保存期为一年左右。
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第二章 菌种扩 大培养
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第二章 菌种扩 大培养
2.2.2 种子罐级数的确定
种子罐级数： 是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
菌种扩大培养的一般流程
菌种扩大培养的一般流程菌种扩大培养是微生物学实验中常见的一项操作，其目的是在较小的培养基中培养并扩大菌种数量，以满足后续实验的需要。
下面将介绍一般的菌种扩大培养流程，以帮助读者了解和掌握这一技术。
第一步：选择适当的培养基菌种扩大培养的第一步是选择适当的培养基。
不同的菌种对培养基的要求不同，因此选择合适的培养基是非常重要的。
一般来说，培养基应包含适当的营养物质，如碳源、氮源、矿物质和水等，以满足菌种生长的需要。
第二步：制备培养基制备培养基是菌种扩大培养的关键步骤之一。
一般情况下，制备培养基需要将适量的培养基粉末溶解在适量的蒸馏水中，并进行加热煮沸，以杀灭其中的细菌和其他微生物。
然后，将煮沸的培养基倒入无菌培养皿或试管中，并在冷却后加入适量的菌种。
第三步：接种菌种接种菌种是菌种扩大培养的关键步骤之一。
接种菌种时，首先需要将菌种从原始培养基中转移到新的培养基中。
这可以通过采用无菌的接种环、接种针等工具，将菌种从原始培养基中接种到新的培养基中完成。
为了确保接种的无菌性，可以在接种后进行密封和贴标。
第四步：培养菌种在接种菌种后，需要将培养基置于适当的环境条件下进行培养。
一般来说，菌种的生长需要适宜的温度、湿度和氧气条件。
因此，在培养过程中需要注意保持适宜的培养环境，并定期观察菌落的生长情况。
第五步：检测菌种的生长情况在培养一定时间后，需要检测菌种的生长情况。
这可以通过肉眼观察菌落的形态、颜色和大小等特征来判断。
同时，也可以采用显微镜观察菌落的细胞形态和结构，以进一步确定菌种的生长情况。
第六步：收获菌种在菌种生长到一定程度后，可以进行菌种的收获。
一般来说，菌种可以通过离心、过滤和冻干等方法进行收获。
收获后的菌种可以用于后续的实验操作或保存在冷冻库中。
菌种扩大培养的一般流程包括选择适当的培养基、制备培养基、接种菌种、培养菌种、检测菌种的生长情况和收获菌种等步骤。
通过掌握和熟练操作这一流程，可以有效地扩大菌种数量，并满足后续实验的需要。
菌种生产技术规程
菌种生产技术规程菌种生产技术规程是指在菌种生产过程中所需要遵循的一系列规定和要求。
菌种生产是指利用微生物菌种进行大规模培养和繁殖的过程，用于生产各种微生物制品、生物农药和发酵工业产品等。
菌种作为微生物生产的基础，其质量和活力的好坏直接影响到最终产品的质量和效果。
因此，菌种生产技术规程的制定和执行对于保证产品质量和提高生产效率具有重要意义。
一、菌种筛选和保存菌种的筛选和保存是菌种生产的第一步。
筛选阶段需要根据产品要求和菌种特性，选择适合的菌株进行培养。
保存阶段则需要制定适当的保存方法和条件，以确保菌种的长期保存和保持活力。
二、菌种扩大培养菌种扩大培养是将筛选出的菌株进行大规模培养的过程。
在菌种扩大培养中，需要控制好培养基的配方和培养条件，以提高菌株的产量和质量。
同时，还需要定期检测和监控培养过程中的菌株活力和纯度，及时调整培养条件，保证菌种的稳定和一致性。
三、菌种质量控制菌种质量控制是菌种生产的核心环节。
在菌种质量控制过程中，需要严格按照规程进行各项检测和测试，确保菌种的纯度、活力和稳定性。
一般包括菌种活力测定、菌种纯度检测、菌种稳定性评价等项目。
同时，还需要建立完善的记录和档案系统，对菌种的生产和质量进行追溯和管理。
四、菌种储存和分装菌种储存和分装是将生产好的菌种进行储存和包装的过程。
在菌种储存过程中，需要选择适当的储存方法和条件，以延长菌种的保质期和保持菌株的活力。
分装阶段则需要制定规范的分装操作流程和标签要求，确保每批菌种的准确性和可追溯性。
五、菌种质量评价和改进菌种质量评价和改进是菌种生产的持续改进环节。
通过对菌种生产过程中的每个环节进行评价和分析，发现问题并制定相应的改进措施，以提高菌种的质量和生产效率。
同时，还需要进行定期的菌种质量评估和审核，及时调整和优化生产流程，确保菌种生产的稳定性和可持续发展。
菌种生产技术规程是菌种生产过程中的重要指导文件，对于保证菌种质量和提高生产效率具有重要作用。
菌种的扩大培养
菌种的扩大培养、污染的检测与判别种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。
人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。
规范了管理措施，设计了一系列设备(例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等)和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。
但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。
凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
发酵污染可发生在各个时期。
种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。
一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。
发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。
发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。
由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。
如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。
染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。
所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。
器材与试剂1.器材高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片2.试剂营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液3.培养基(1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH 7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。
菌种扩大培养的一般流程
菌种扩大培养的一般流程菌种扩大培养是微生物学中的重要实验技术，用于大规模生产菌种或菌株，以满足不同领域的研究和应用需求。
本文将介绍菌种扩大培养的一般流程。
一、菌种的保存与激活菌种的保存是保证后续扩大培养的重要步骤。
常见的保存方式包括冷冻保存和冻干保存。
在开始扩大培养之前，需要将保存的菌种进行激活，使其恢复生长活力。
二、菌种的预培养为了保证扩大培养的成功，需要进行菌种的预培养。
首先，从保存的菌种中挑取一部分菌落，接种到适宜的培养基上，进行预培养。
预培养的时间一般为16-24小时，使菌种处于快速生长期，为后续扩大培养做好准备。
三、选择合适的培养基菌种的扩大培养需要选择合适的培养基。
不同的菌株对培养基的要求有所不同，一般包括碳源、氮源、无机盐等。
根据菌株的需求，选择适当的培养基，以提供充足的营养物质，促进菌种的快速繁殖。
四、扩大培养的条件控制菌种的扩大培养需要控制一系列的条件，包括温度、pH值、氧气供应等。
一般情况下，细菌的培养温度为37℃，真菌的培养温度为25℃。
同时，要根据菌种的特性，调节培养基的pH值，以提供最适宜的环境。
对于需氧生长的菌种，需要提供充足的氧气供应。
五、菌种的扩大培养策略菌种的扩大培养可以采用不同的策略，包括液体培养和固体培养。
液体培养适用于大规模生产菌液，可以采用摇瓶培养或发酵罐培养。
固体培养适用于大规模生产菌落，可以采用平板培养或培养瓶内的固体培养。
根据具体情况选择合适的培养策略，以满足菌种扩大培养的需求。
六、菌种的收获与保存扩大培养结束后，需要收获菌液或菌落，并进行保存。
对于菌液，可以通过离心分离菌体，得到菌体沉淀，并进行冷冻保存。
对于菌落，可以进行冷冻保存或进行冻干保存。
保存菌种的目的是为了后续的实验和应用。
总结起来，菌种扩大培养的一般流程包括菌种的保存与激活、菌种的预培养、选择合适的培养基、扩大培养的条件控制、菌种的扩大培养策略，以及菌种的收获与保存。
通过合理控制每个环节，可以有效地扩大培养菌种，满足科研和实际应用的需求。
《菌种扩大培养》课件
菌种扩大培养是微生物实验和工业生 产中的重要环节，它能够提供足够数 量的微生物用于实验或生产，是实现 微生物利用的关键步骤。
菌种扩大培养的基本原理
生长曲线
菌种扩大培养需遵循微生物的生长曲线，即适应期、对数生长期和稳定期。在适应期，微 生物需要适应新的环境；在对数生长期，微生物快速分裂繁殖；在稳定期，微生物繁殖速 度减缓，细胞开始出现分化。
菌种活性检测
定期检测菌种的活性，确保菌种在 培养过程中保持较高的活性。
03
菌种扩大培养的技术与设备
微生物培养技术
微生物培养基
选择适宜的培养基成分，如碳源、氮 源、无机盐等，以支持微生物的生长 和繁殖。
无菌技术
培养条件控制
根据微生物的特性，控制培养温度、 湿度、pH值等条件，以获得最佳生长 效果。
工业生产
在工业生产中，菌种扩大 培养可用于发酵、酶工程 、生物制药等领域，提供 足够数量的目的产物。
农业生产
在农业生产中，菌种扩大 培养可用于菌肥、生物农 药等的生产，提高农作物 的产量和品质。
02
菌种扩大培养的步骤
菌种选择与纯化
菌种选择
选择适合工业化生产的菌种，考 虑其生长速度快、产率高、对环 境的适应性等。
新型发酵技术如连续发酵、分批补料发酵等能够提高菌种的发酵效率和产物得率 ，降低能耗和资源消耗。
新型发酵技术还有助于解决传统发酵工艺中存在的瓶颈问题，如高细胞密度培养 和产物抑制等，为菌种扩大培养提供新的解决方案。
智能化、自动化技术的进一步发展
智能化、自动化技术能够实现菌种扩大培养过程的实时监测 、控制和优化，提高培养过程的稳定性和可重复性。
《菌种扩大培养》PPT课件
目录 Contents
食用菌栽培与加工 02菌种扩大培养
2013-8-15
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种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些 纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长， 迟缓期短； （2）生理性状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。
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冷藏时间对孢子生产能力也有影响。例如在链霉素生产中， 斜面孢子在6℃冷藏两个月后发酵单位比冷藏一个月降低18%， 冷藏3个月后降低35%。 4、接种量 接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体 的生理状况。也影响到菌种的适应期。
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二、影响种子质量的因素及控制 生产过程中影响种子质量的因素通常有：孢子的质量、培养 基、培养条件、种龄、接种量。 1、培养基 种子培养基要满足以下要求： （1）营养成分适合种子培养的需要 （2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； （3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用； （4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高 （5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
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2、培养条件 （1）温度 （2）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有 足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在 制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入 发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉 素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。
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例如:
菌种扩大培养的一般流程
菌种扩大培养的一般流程菌种扩大培养是微生物学研究中的一项重要技术，在生物制药、食品工业等领域也有广泛应用。
本文将介绍一般的菌种扩大培养流程，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
一、菌种的选择菌种的选择是菌种扩大培养的第一步。
在选择菌种时，需要考虑其特性、用途和所需培养条件等因素。
一般来说，菌种应具有较好的生长特性、产生目标产物的能力以及较高的稳定性。
二、菌种的预培养菌种的预培养是为了获得足够数量的起始菌株。
首先，将菌种从冷冻保存物中取出，接种到适当的培养基中，进行预培养。
预培养的目的是让菌种活化并适应培养基的环境，以提高后续扩大培养的成功率。
三、扩大培养的前期准备在进行扩大培养之前，需要准备好培养基、培养设备和相关试剂等。
培养基的选择应根据菌种的需求和培养目的来确定，一般包括碳源、氮源、无机盐和其他必需因子等。
培养设备的清洁和消毒也是保证扩大培养成功的重要步骤。
四、扩大培养的操作步骤1. 将预培养的菌种转接到扩大培养所需的培养基中，并进行初级培养。
初级培养的目的是让菌种适应新的培养基和环境，逐渐增加菌体数量。
2. 根据菌种的生长特性和需求，调节培养条件，如温度、pH值、氧气供应等。
保持适宜的培养条件可以促进菌种的生长和产生目标产物。
3. 定期监测培养物的生长情况，包括菌体数量的增长、生长曲线的变化以及培养基中目标产物的积累情况等。
监测结果有助于调整培养条件，以获得最佳的扩大培养效果。
4. 在菌种生长达到一定阶段时，可以进行菌体的分离和提取。
常用的方法包括离心、超滤和柱层析等。
分离和提取的目的是纯化目标产物并减少其他杂质的干扰。
五、扩大培养的后期处理完成扩大培养后，需要对培养物进行后期处理。
常见的处理方法包括杀菌、浓缩、冻干等。
后期处理的目的是保持菌种的活性和稳定性，以便于后续的存储和应用。
六、菌种的存储菌种的存储是为了长期保存和保持菌种的活性。
常用的存储方法包括冷冻保存、冻干保存和液氮保存等。
存储条件的选择应根据菌种的特性和需求来确定，以确保菌种的长期稳定性和可用性。
第二章 菌种扩大培养
种子质量的控制措施
菌种稳定性的检查 将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释， 将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释， 然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养， 然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出 菌落， 菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体 摇瓶培养， 摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用 杂菌检查 显微镜观察，或平板培养试验， 显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在 平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落， 平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定 时检查， 时检查，防止漏检
(250ml 500ml麦麦 麦) 2d
1000ml 三三 三
25 oc
5 10 L子制备
在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以 无菌的方式接至适合的斜面培养基上， 无菌的方式接至适合的斜面培养基上， 培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试 管斜面并至摇瓶。 管斜面并至摇瓶。
种子罐级数的确定
种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大 培养的次数 对于生长快的细胞， 对于生长快的细胞，种子用量的比例 即需要的接种量少， 少，即需要的接种量少，所以相应的种 子罐也少
接种种龄和接种量
接种龄 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间 接种量 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后 培养液体的体积的比例 种子质量的判断
第二章
菌种的扩大培养
定义：菌种的扩大培养就是把保藏的 菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处 于休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子 罐，逐级扩大培养后达到一定的数 量和质量的纯种培养过程。这些纯 种的培养物称为种子。
种子必须具备的条件
①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐 菌种细胞的生长活力强， 中能迅速生长 ②生理性状稳定 ③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要 求 无杂菌污染（不带杂菌） ④无杂菌污染（不带杂菌） ⑤生产能力稳定
2 发酵工程的菌种及其扩大培养
是酿酒重要霉菌，也是酸性蛋 白酶和腐乳生产中的重要菌种。
2、毛霉 ( Mucor ) 鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 从我国小曲中分离出来； 能糖化淀粉且能生成少量酒精； 能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力， 常用来制作腐乳 总状毛霉 ( Mucor racemosus ) 是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地 土壤中、一些生霉的材料上、空气中都能找到； 酒曲中常见 可制作豆豉
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、 色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；有些菌 株可利用烃类生产SCP。
（二）放线菌（actinomyces）
因其菌落呈放射状而得名 属原核微生物类群，在自然 界中分布很广，尤其在有机 质丰富的微碱性土壤中较多。 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余 种，60%左右来自放线菌）， 经济价值大
（六）噬菌体（phage）
危害以细菌和放线菌为生产菌 株的发酵工业。
烈性噬菌体 ——引起寄主细胞迅速裂解。 受感染的细菌称敏感性细菌。 温和噬菌体 ——随寄主细胞的繁殖而繁殖。 含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。
吸附
释放
注入核酸
装配
合成核酸和蛋白质
二、微生物工业对菌种的要求 1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。
第一节 发酵工程菌种的分离和筛选
一、菌种的来源 向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性， 采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生 产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。
细菌扩大培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握细菌扩大培养的基本原理和方法。
2. 了解不同细菌生长特点及其对培养基的要求。
3. 培养学生的实验操作技能，提高无菌操作意识。
二、实验原理细菌扩大培养是指在实验室条件下，通过增加培养液的体积，使细菌数量迅速增加的过程。
扩大培养是微生物研究、生产及应用中的重要环节，如菌种保存、发酵生产等。
扩大培养过程中，需注意以下几点：1. 选择合适的培养基，以满足细菌生长需求。
2. 控制培养条件，如温度、pH值、氧气等，以利于细菌生长。
3. 采用无菌操作技术，防止杂菌污染。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。
2. 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 准备培养基：根据细菌生长需求，配制牛肉膏蛋白胨培养基。
将培养基分装于锥形瓶中，高压蒸汽灭菌后备用。
2. 接种：将待扩大培养的细菌从斜面培养基上挑取适量菌种，接种于锥形瓶中的培养基中。
3. 培养条件：将接种后的锥形瓶置于适宜温度的培养箱中，培养一段时间，使细菌数量迅速增加。
4. 观察与记录：定期观察培养液中的细菌生长情况，记录细菌数量、颜色、形态等特征。
5. 收集培养液：当细菌数量达到预期时，收集培养液，用于后续实验或生产。
五、实验结果与分析1. 大肠杆菌扩大培养：将大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，细菌数量从1.0×10^5 CFU/mL增长至1.0×10^8 CFU/mL。
2. 金黄色葡萄球菌扩大培养：将金黄色葡萄球菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，细菌数量从1.0×10^5 CFU/mL增长至1.0×10^7 CFU/mL。
3. 枯草芽孢杆菌扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，细菌数量从1.0×10^5 CFU/mL增长至1.0×10^6 CFU/mL。
菌种扩大培养技术
（二）一级种子培养
摇瓶培养基组成：葡萄糖 25 g/L，尿素5 g/L，
MgSO4·7H2O 0.5 g/L，磷酸二氢钾 1.2 g/L， 玉米浆 25~35 g/L （根据玉米降质量指标增减用量）， 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm，调节pH 7.0， 每个1000mL三角瓶分装培养基200mL， 121℃灭菌20min。 （培养基成分可因菌种不同酌情增减。）
四、生产车间菌种培养技术
在以种子罐进行种子扩大培养流程中，种子罐 级数根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所 采用发酵罐的容积而定。
例如：在青霉素发酵生产中，将孢子悬浮液接入 一级种子罐，于27℃培养40h ，孢子发芽，长出 短菌丝，然后移接至新鲜培养基的第二级种子罐， 于27℃培养10~24h ，菌丝迅速繁殖并获得粗壮菌 体，方可作为种子接入发酵罐，整个过程采用了 二级种子罐的扩大培养。
一级种子培养设备
一级种子培养设备
一级种子培养设备
一级种子培养设备
为什么要振荡培养？
（1）菌体与底物充分接触
（2）增加溶氧
振荡培养需控制哪些要素？
（1）温度
（2）pH
（3）振幅
（4）频率
（5）装液量
摇瓶培养条件因菌种不同而异，对于好氧性微生 物菌种，振幅、振荡频率、装液量以及瓶口覆盖 的纱布等对氧气的溶解程度均有较大影响，应加 以严格控制。 摇瓶培养成熟后，可存放于4℃冰箱内备用，保存 时间不超过一天。
● 培养成熟的种子液，经取样检验正常后，方 可移接下一级。
（二）谷氨酸二级种子培养
1. 培养基组成 实例一：
葡萄糖 25g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L ， 磷酸二氢钾 1.5 g/L ，糖蜜 125g/L ， 玉米浆 250g/L ，纯生物素 18.8 μg/L ， 尿素 5g/L ，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm ， 调节pH7.0 ，实消， 121℃保温10min。
第一章菌种扩大培养
3、种龄 种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培 养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时 的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶 ；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。 不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种 实验来确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。
4、接种量 接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的 接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来 ，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大 会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过 小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。通常接种量，细菌1~5%，酵母菌 5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%
3、确定种子罐级数需注意的问题 （1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 （2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐 的生产率，增加染菌机会 （3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与
所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子
发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
表2-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响
相对湿度 （%） 16.5~19 25~36 40~45 斜面外观
上部稀薄下部稠略黄 上部薄中部均匀发白 一 片白 ，孢子 丰富 ， 稍皱
活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
3、培养时间和冷藏时间 （1）培养时间 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已 在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子 会导致生产能力的下降。 解决措施： 孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量 正常的阶段终止培养。 （2）冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生 产菌种孢子斜面培养4d左右即于4℃冰箱保存，发现冷藏7-8d菌 体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。
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（一）孢子的制备 1、细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富。 培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间1~2d，产芽孢的 细菌培养5~10d。 2、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等 天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时 间一般为4~14d。 3、放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无 机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间5~14d。
例如:
生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基 （培养基配制：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g 葡萄糖和20g琼脂于1L水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每 年移种3-4次。 将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中， 再于25℃培养2-3d。 再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再 于25℃培养2d. 移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养35d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培 养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有 利与酵母菌的增殖。
第二章 发酵的流程及菌种扩 大培养
2009.10
第一节 发酵的特点及流程
一、发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化 学反应。其主要特点如下： 1、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学 反应，反应安全，要求条件也比较简单。 2、发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为 主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因 不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特 性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改 造和更新。
第三节 种子质量的控制 一、影响孢子质量的因素及控制 影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间 和冷藏时间等。 1、培养基 种子质量不稳定的主要原因是原材料质量波动。 例如：在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用 的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质 量的影响也不同。 蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响不同。 原材料质量的波动，也会影响孢子质量。如微量元素Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢 子的质量。
二、生产车间种子制备 种子罐的培养基因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌 利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等， 需氧菌，还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（ 丝）体在培养液中均匀分布。 1、种子罐的作用 使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速 生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2、种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决 于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； （2）所采用发酵罐的容积。
（二）液体种子制备 1、好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰 色链霉菌（S. griseus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含 液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子 。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2、厌氧培养 酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）其种子的制备过程如下： 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
三、种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产 能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子 培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。因此在生 产过程中通常进行以下两项检查。 （1）菌种稳定性的检查 （2）无（杂菌）检查
3、确定种子罐级数需注意的问题 （1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 （2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐 的生产率，增加染菌机会 （3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与
所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子
发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些 纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长， 迟缓期短； （2）生理性状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。
水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造 成水质波动，影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮 源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。 解决措施： （1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用； （2）严格控制灭菌后培养基的质量； （3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间； （4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选 种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。
7、工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，可以取得显著 的经济效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发 酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优 越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以 用人工构建的“工程菌’来进行反应；反应设备也不只是常规 的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续 化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。
4、接种量 接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可 以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌 的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响 产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵 罐的生产率。通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%
表2-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响
相对湿度 （%） 16.5~19 25~36 40~45 斜面外观
上部稀薄下部稠略黄 上部薄中部均匀发白 一 片白 ，孢子 丰富 ， 稍皱
活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
3、培养时间和冷藏时间 （1）培养时间 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已 在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子 会导致生产能力的下降。 解决措施： 孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量 正常的阶段终止培养。 （2）冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生 产菌种孢子斜面培养4d左右即于4℃冰箱保存，发现冷藏7~8d菌 体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。
3、种龄 种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时 间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成 发酵前期生长缓慢。 不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来 确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。
二、发酵过程的组成部分
1、发酵过程的组成 除某些转化过程外，典型的发酵过程可以划分成六个基 本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌； （3）培养有活性、适量的纯种，接种入生产容器中； （4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐 中生长； （5）产物萃取和精制； （6）过程中排出的废弃物的处理。 六个部分之间的关系如图所示。在建立发酵过程以前， 首先要分离出产生菌，并改良菌种，使所产生的产物符合 工业要求。
3、发酵生产的条件 （1）某种适宜的微生物 （2）保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培 养基组成，温度，溶氧pH等） （3）进行微生物发酵的设备 （4）提取菌体或代谢产物，精制成产品的方法和 设备
第二节
生产菌种的扩大培养
发酵罐容积几百立方米。 生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。 其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。 如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能 力的大小；营养、温度、需氧等条件要求均有所不同。 种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培 养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。种子接入发 酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种 子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。
在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段： （1）实验室种子制备阶段
（2）生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式： 产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用 固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样 操作简便，不易污染杂菌。 产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可用液体培养法。
3、发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应 的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。 4、由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高 度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还 原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。 5、发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设 备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进 行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是 感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条 件是发酵成败的关键。 6、微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛 选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也 可以因 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40h孢子发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（27℃，10~24h，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体 ）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子