第三章、基因工程常用受体细胞
基因工程第三章
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
2023年人教版高中生物选择性必修3第3章基因工程第3节基因工程的应用
第3节基因工程的应用【课程标准】举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。
【素养目标】1.科学思维:基于基因工程在农牧、医药和食品等行业应用的实例,说明基因工程给社会带来的巨大进步。
2.社会责任:基于基因工程在各方面发展的前景,理性看待基因工程的安全性。
你听说过转基因鲤鱼吗?转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%~115%,它在142天后平均体重达到648 g。
除生长速度快,转基因鲤鱼对饵料的利用率也非常高,这两个因素使得转基因鲤鱼的养殖经济效益比非转基因鲤鱼提高125%。
观看视频《快速生长的转基因黄河鲤鱼》。
思考:1.提高鲤鱼生长速度的目的基因是什么?2.你还知道哪些转基因生物?基因工程有哪些方面的应用?一、基因工程在农牧业方面的应用连一连:基于基因工程在改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量等方面的应用,将下列转基因生物和选用的目的基因连线。
【警示】转基因抗虫植物与转基因抗病植物是不同的,转基因抗病植物可以抵抗病毒、真菌等,但不能抗虫。
二、基因工程在医药卫生领域的应用判一判:基于基因工程在医药卫生领域的成果和应用,判断正误。
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造,使它们能够生产药物。
(√)②乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。
(×)提示:需将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起后导入受精卵中。
③转基因动物需要进入泌乳期才能成为“乳腺生物反应器”。
(√)④用转基因动物做器官移植的供体时,只能通过抑制供体动物抗原决定基因的表达来解决免疫排斥的问题。
(×)提示:还可以设法除去抗原决定基因。
思考:作为乳腺生物反应器的动物,对性别有怎样的要求?提示:应为雌性动物。
三、基因工程在食品工业方面的应用1.基因工程菌:用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类。
2.选一选:以下叙述属于基因工程在食品工业方面应用的是①③。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
第三章基因工程常用受体细胞
是一种甲基营养菌，能在相 对较为廉价的甲醇培养基中 生长。
优点
除具有一般酵母所具有的特点 外，还有以下几个 优点： 1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一 －乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量 高（一般 500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到 12g/l） 。 2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。 3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)） 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
一、酿酒酵母
是第一个用于基因药物表达的酵母菌， 遗传背景已相当清楚：有17条染色体， 1996年完成其全基因组测序，基因组为 12068 kb，阅读开放开架5887个，编码 约6000个基因，比单细胞的原核生物和 古细菌大一个数量级。 受体细胞举例：酿酒酵母GRF18
（二）缺点
1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA， 只能表达cDNA； 2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进 行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、 酰胺化等修饰作用；
蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从 而获得功能性分子 糖基化意义： 赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性
菌体内 稍复杂 简单
不大
哺乳动物
需注意 致癌
第三节、常用原核表达细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌
一、大肠杆菌表达体系
（一）生物学特性 革兰氏阴性杆菌 大小2～4um×0.4～ 0.1um； 无芽孢； 一般无荚膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂， 37℃17分钟繁殖一代。
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
第三章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序
第2节基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取1．培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的筛选与获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因的筛选与获取目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
(1)筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
②目的：快速扩增目的基因。
③原理：DNA半保留复制。
④基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。
⑤过程a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
⑧仪器：PCR扩增仪。
(3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
【强化记忆】图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？提示第3轮。
(2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。
【课后集训】第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具(含答案详解)
2019版生物选择性必修3 课后集训第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具题组一基因工程的概念及诞生和发展1．下列叙述符合基因工程概念的是()A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的大肠杆菌菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上2．下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是()A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据D．基因工程必须在同物种间进行题组二限制酶和DNA连接酶3．根据下图判断，下列有关工具酶功能的叙述，错误的是()A．限制酶可以切断a处B．DNA聚合酶可以连接a处C．解旋酶可以使b处解开D．DNA连接酶可以连接c处4．下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是()A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能C．DNA连接酶的作用位点是b处D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段5．有关DNA重组技术的工具酶的叙述，正确的是()A．限制性内切核酸酶能切割烟草花叶病毒的核酸B ．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C ．所有DNA 连接酶都能连接黏性末端和平末端D ．DNA 连接酶和DNA 聚合酶均可用来拼接DNA 片段6．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )A ．用限制酶切割一个DNA 分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B ．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的概率就越大C ．限制性内切核酸酶的活性不受温度、pH 等条件的影响D ．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒 题组三 基因进入受体细胞的载体7．下列关于基因工程操作工具——载体的叙述中，错误的是( )A ．质粒作为常见的载体，不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B ．作为基因工程的载体，标记基因不可或缺C ．目的基因插入载体时，有特定的插入位点D ．构建重组DNA 分子时需DNA 连接酶和限制性内切核酸酶等8．限制酶Mun Ⅰ和限制酶Eco R Ⅰ的识别序列及切割位点分别是－CA ↓ A TTG －和－GA ↓ATTC －。
高中生物选择性必修三 第3章 第3节 基因工程的应用
学习目标
1.举例说明基因工程在农牧业、医药卫生及食品工业 的应用。 2.举例说出日常生活中的转基因产品,理性看待基因工 程给我们的生产和生活带来的影响。
一、基因工程在农牧业方面的应用 1.转基因抗虫植物 (1)方法:从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因,将其导入作物 中。 (2)成果:转基因抗虫棉花、玉米、水稻等。 (3)意义:减少化学杀虫剂的使用,降低生产成本,减少环境污染。 2.转基因抗病植物 (1)方法:将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中。 (2)成果:转基因抗病毒甜椒、番木瓜等。 (3)意义:能获得用常规育种方法很难培育出的抗病的新品种。
答案D 解析萤火虫与烟草的遗传物质都是双链DNA,这是完成基因重组的 基础,①正确;自然界的所有生物几乎都共用一套遗传密码,②正确; 萤火虫的荧光素基因导入烟草细胞使得该转基因植株通体光亮,可 见荧光素基因在该植株中成功表达,即烟草体内合成了荧光素,③ 正确;萤火虫与烟草细胞合成蛋白质的方式基本相同,都是以mRNA 为模板,在核糖体上,经氨基酸脱水缩合形成蛋白质,④正确。
探究点一
探究点二
答案C 解析重组质粒形成后需要通过农杆菌转化法等方法导入棉花的叶 肉细胞;如果抗虫基因导入棉花叶肉细胞的细胞质中,转基因棉花 的花粉中不含该基因,如果导入细胞核基因中,该转基因植株相当 于杂合子,后代会发生性状分离;抗虫棉的选择作用使具有抗性突 变的棉铃虫生存下来,经过长时间积累,棉铃虫的抗性会增强。
2.科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞并获得高水平 的表达。长成的烟草植株通体光亮,堪称自然界的奇迹。这一研究 成果表明( ) ①萤火虫与烟草的DNA结构基本相同 ②萤火虫与烟草共用一套遗传密码 ③烟草体内合成了荧光素 ④萤火虫和烟草合成蛋白质的方式基本相同 A.①③ B.②③ C.①④ D.①②③④
第3章 基因工程 期末复习知识点总结【新教材】人教版高中生物选择性必修三
第3章基因工程1、什么是基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
1)理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2)技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用●理论上的三大发现⑴、发现了遗传物质——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
●技术上的三大突破⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA 和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
第3章基因工程(单元知识清单)(答案版)
第三章基因工程知识清单第1节重组DNA技术的基本工具一、重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
(5)基因转移载体和限制酶、DN连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6)DNA体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)PCR技术的发明。
(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)—“分子手术刀”●已知限制酶Eco R Ⅰ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
Eco R Ⅰ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
(2)DNA连接酶—“分子缝合针”①作用：DNA连接酶能够将DNA片段连接起来。
②分类：基因工程常用的DNA连接酶有两种：● E.coli DNA连接酶：连接互补的黏性末端，不能连接平末端。
● T4 DNA连接酶：连接互补的黏性末端和平末端。
(3)载体——“分子运输车”①基因工程通常利用质粒作为载体将基因送入细胞。
质粒是独立于细胞核或拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状DNA分子。
●质粒DNA分子上有一个或多个限制酶切割位点，可供外源基因插入其中。
●携带外援DNA片段的质粒进入受体细胞后，能够在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA的同步复制。
质粒上常有特殊的标记基因，如抗性基因，便于重组DNA分子的筛选。
②基因工程常用的载体除质粒外，还有噬菌体、动物病毒等。
二、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.DNA的粗提取与鉴定实验原理(1)DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精。
基因工程：第三章 大肠杆菌基因工程
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
高效转录 O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控
lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基
底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
高水平转录 阻遏蛋白
l噬菌体启动子PL / PR
受CI阻遏蛋白阻遏
阻遏作用
常采用温度敏感型突变cI857
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，
Ptrp
PL便可介导目的基因的表达。但
在大型细菌培养罐中迅速升温非
常困难，因此常使用一个双质粒
控制系统，用色氨酸间接控制目
的基因表达。 Ptrp
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达水平高，遗传较稳定 优良的工业性能： 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统
一、大肠杆菌表达系统的优缺点 你有不足，但你仍是最爱——缺点
缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖 基化蛋白、结构复杂的蛋白等） 胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵 体），分泌机制不完善 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
组成型与诱导型启动子
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1。
什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程(Genetic engineering）原称遗传工程.从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素.1。
分离目的基因2。
限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养5。
选择、筛选含目的基因的克隆6。
培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
➢具有合适的筛选标记.➢分子量小，拷贝数多.➢具有安全性。
2。
质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1。
克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4。
穿梭质粒5.探针质粒6。
表达质粒3。
质粒的构建(1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量.一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定.(2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点,使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5)根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
基因工程受体细胞
其缺点：细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致 人体的热源反应
2、枯草杆菌
除具有大肠杆菌的优势外，其自身的优势为：
（1）枯草杆菌具有胞外酶分泌—调节基因，能将基因表 达产物高效分泌到培养基中，大大简化蛋白表达产物的 提取和加工处理，而且在大多数情况下，真核生物的异 源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然构象和生物活 性。 （2）不产生内毒素，无致病性，是一种安全的工程菌
★原核细胞多数为单细胞生物，容易获 得一致性的实验材料，并且培养简单， 繁殖迅速，实验周期短，重复试验快
常用的几种原核细菌
1、大肠杆菌
大肠杆菌是革兰氏阴性菌，一些菌株的染色体已测 序完毕，如：K-12美MG1655的全基因组长4000kb, 共 含有4405个开放阅读框架，其大部分基因的生物功能已 被鉴定。
植物细胞
植物细胞与原核细 胞的区别？？？
植物细胞（拟南芥菜、烟叶等等） 作为受体细胞：最突出的优点是（细胞的全能性），原生
即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易分 质 化为再生植株（这意味着获得外源基因的体细胞可以 体 培养出稳定遗传的植株或品系）
遗传操作繁
适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的 生产，农作物品质的改良
动物细胞
动物细胞也可作为受体细胞，早期 多采用生殖细胞，受精卵或胚细胞；现 在也可以使用体细胞。
哺乳动物细胞作为受体细胞的优点：
（1）能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪 接加工成成熟的mRNA (2)真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确的加 工和修饰，产物具有较好的蛋白质免疫性，为 酵母菌的16---20倍
从受体菌的角度出发，通常是对其进行适当的修饰改造， 如选用某限制性内切酶缺陷的受体细胞就可以避免其对 重组DNA分子的降解破坏作用
基因工程的载体和受体
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Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the
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（2）一个合格质粒的组成要素
复制起始位点Ori：控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起 始点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因：便于对目的基因的检测，如Amp、Kan。 多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段。 P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子。 T（Terminator）：终止信号。 poly(A)加尾信号：稳定mRNA。
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（1）质粒改造策略
删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片 段的装载量。 灭活某些质粒的编码基因。 加入易于识别的选择标记基因。 选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列--多克隆接头(Polylinker)。 加入特殊的基因表达调控元件。
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（4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
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（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例：
高三生物一轮复习选择性必修3第三章基因工程知识点梳理
第三章基因工程知识点梳理第一节重组DNA技术的基本工具1.实施基因工程的最终目的：定向改造生物的遗传性状2.DNA酶的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为它的基本单位脱氧核苷酸3.限制酶（限制性内切核酸酶）的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为DNA分子的片段4.DNA连接酶的作用：能连接两个具有碱基互补配对的DNA片段之间的磷酸二酯键5.DNA聚合酶的作用：能把游离的脱氧核苷酸连接在引物的3，端6.解旋酶的作用：断开DNA两条链之间的氢键7.基因工程的基本工具：（1）分子手术刀—限制性内切核酸酶简称限制酶功能：识别和断开DNA分子的特定核苷酸序列如：EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：GAATTC，断开G,A之间的磷酸二之间,形成黏性末端Sma1EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：CCCGGG，断开C,G之间的磷酸二之间,形成平末端（2）分子缝合针—DNA连接酶功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
DNA连接酶有上千种，可以分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的E.coliDNA连接酶，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。
T4DNA 连接酶既可以缝合黏性末端又可以缝合平末端，但连接平末端的效率相对较低。
（3）分子运输车—基因进入受体细胞的载体外源基因怎样送入细胞? 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
8.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
在基因工程中使用的载体除了质粒还有噬菌体，动植物病毒等。
9.成为载体的条件：（1）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制（2）有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选。
（3）有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中（4）对受体细胞无害10.DNA的粗提取与鉴定（1）选择富含DNA的生物组织使细胞内容物溶出。
基因工程基础知识复习归纳
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体〔供体〕的基因与载体在体外进展拼接重组，然后转入另一种生物体〔受体/宿主〕内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的开展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆〔Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程〞、“DNA重组〞为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因〔供体〕：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子〔克隆载体、表达载体〕。
宿主〔受体〕：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞〔组织、器官或个体〕。
4.基因工程的根本步骤〔切、接、转、增、检〔大肠杆菌是中心角色〕〔1〕目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，别离出带有目的基因的DNA片断。
〔2〕重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记〔抗菌素抗性〕的载体分子上。
〔3〕重组体的转化：将重组体〔载体〕转入适当的受体细胞中。
〔4〕克隆鉴定：摘要转化成功的细胞克隆〔含有目的基因〕。
〔5〕目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
dna的增色效应名词解释
dna的增色效应名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和dna重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
工具(1)酶：限制性核酸内乌酶、dna连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、ti质粒、人工染色体1.抽取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
必须从茫茫的“基因海洋”中赢得特定的目的基因，就是十分难于的。
科学家们经过坚持不懈地积极探索，编出了许多办法，其中主要存有两条途径：一条从可供体细胞的dna中轻易拆分基因;另一条就是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的dna切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的dna(即外源dna)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用pcr技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的dna片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法赢得目的基因的优点就是操作方式方便快捷，缺点就是工作量小，具备一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因所含不抒发的dna片段，通常采用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使rna为模版，反转录成互补的单链dna，然后在酶的作用下合成双链dna，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使rna序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
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第二节、宿主细胞分类及特点
分类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽胞 杆菌、链霉菌等）
真核细胞（酵母细胞、哺乳动物
细胞、昆虫细胞）
一、原核表达系统的特点
（一）优点：
1、 结构简单，基因组成及功能相对清楚， 易于遗传操作及转化
2、生理代谢途径及表达调控机制相对清楚， 便于表达调控
3、生长迅速，要求条件低（大肠杆菌倍增 时间为17分钟），易于大规模培养。
3、胞内表达产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基（由起 始密码ATG编码），影响活性或容易引起免疫反应
4、 细胞壁含脂多糖（内毒素），增加了分离纯化难度
包涵体
细胞内由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或 无膜的水不溶颗粒状物（相差显微镜或电子显微 镜下可见）。
组成： 1、外源重组蛋白：50％以上 2、宿主蛋白：RNA聚合酶、核糖核蛋白体、外膜
用于接受质粒： C600 W3110 HB101 JM83 JM101（Aps、Tcs、Cms）
用于接受l-DNA： LE392、ED8654
二、芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表 达体系
（一）生物学特性 革兰氏阳性杆菌 大小0.7～0.8×2～
3m 能产生芽孢；
（二）特点
第三章：基因药物体外表达的 受体细胞
第一节、宿主细胞选择原则
1、容易获得较高浓度的细胞； 2、安全，不致病； 3、遗传背景清楚，容易进行DNA重组操作及遗传改造； 4、产物的产量高（表达水平和稳定性） 、生物活性高 5、产物容易提取纯化。 6、容易进行代谢调控； 7、易培养（生长速度、营菌表达 系统及载体
枯草芽孢杆菌：蛋白分泌能力强，但同时至少分 泌6种蛋白酶
短小芽孢杆菌：蛋白分泌能力与枯草芽孢杆菌接 近，但胞外蛋白酶活性远低于枯草芽孢杆菌，且 可分泌蛋白酶抑制剂
2、培养液中产物浓度较小 3、转化细胞筛选麻烦
主要基因工程表达体系比较
表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性
大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 融合蛋白质
容易
一般
部分高产
对原核好 对真核差
不大
酵 母 多肽蛋白质 菌体内 糖基化蛋白 外分泌
容易 可高产
菌体内 真核的接近 稍复杂 天然产物
3、不具备真核生物的蛋白质复性系统（如蛋白二 硫键异构酶），不能进行真核蛋白的正确折叠；
二、酵母（yeast）表达体系特点
酵母菌是最简单的真 核单细胞生物；
是外源真核基因最理 想的表达体系。
（一）优点：
1、全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， 遗传操作简便 2、具有原核生物无法比拟的蛋白翻译后加工修 饰系统。对表达的蛋白可进行正确折叠和糖基化、 磷酸化等修饰； 3、安全：不含特异病毒、不产生毒素，美国FDA 认定为安全的 4、繁殖迅速（倍增期约2小时 ），要求条件低， 大规模发酵工艺简单，成本低廉； 5、能外分泌
37℃17分钟繁殖一代。
（二）特点
优点：
1、载体受体系统完备 2、外源基因表达水平高，可达总蛋白5％～
30％； 3、下游技术成熟
缺点：
1、 胞内表达蛋白易形成无活性的包涵体，需进行复性操作； 可溶性表达的胞内真核蛋白易被细菌蛋白酶水解
2、蛋白分泌机制不健全，外源真核基因很难实现分泌表达， 且分泌产物大多只能分泌到细胞周质（细胞质与外膜之见 的间隙）；少数分泌表达的蛋白表达效率比包含体形式低 很多。
（二）缺点：
1、生长相对细菌缓慢 2、对有些生物活性蛋白仍无法表达或正确修饰，
比如蛋白超糖基化
超糖基化修饰作用
酵母菌糖蛋白的N－糖基外链的组成成分只有甘露 糖，但其分支结构极为复杂的的现象称为超糖基化 修饰作用。
O－寡聚多糖链 N－糖基外侧链
酵母菌 甘露糖单体 甘露糖
高等真核生物 唾液酸基团 甘露糖
优点： 1、具有高效分泌机制，可将表达的外源蛋白
高效分泌到培养基中，且多数真核蛋白经 芽孢杆菌分泌后便具有天然构象和生物活 性 2、胞壁不含脂多糖，不产生内毒素
缺点
1、载体受体系统不完备 2、常规方法不易转化 3、野生型芽孢杆菌合成和分泌大量的胞外蛋白酶，
直接影响表达产物的稳定性 4、发酵技术不如大肠杆菌成熟
N－乙酰葡萄糖胺 半乳糖 果糖
唾液酸等
N-连接糖基化(N-linked glycosylation)
新合成蛋白进行糖基化修饰的一种方式。 糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH2基连
接，所以将这种糖基化称为N-连接的糖基化。
O-连接的糖基化（O-linked glycosylation）
高尔基体中进行的另一种蛋白质的糖基化， 将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟 赖氨酸的羟基的氧原子上。
不大
哺乳动物 完 整 外分泌 糖基化蛋白
较难成本高 简单 可高产
可达天然 产物
需注意 致癌
第三节、常用原核表达细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌
一、大肠杆菌表达体系
（一）生物学特性 革兰氏阴性杆菌 大小2～4um×0.4～
0.1um； 无芽孢； 一般无荚膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂，
蛋白等 3、质粒编码蛋白：如标记基因产物 4、非蛋白分子：DNA、RNA、脂多糖等 蛋白特点：氨基酸序列组成正确，空间构象往往错误
（三）在基因工程中的应用
扩增外源DNA（双链、单链） 构建基因（DNA、cDNA） 高效表达原核生物基因 表达不需翻译后加工、修饰的真核蛋白
五、实验室常用的大肠杆菌
（二）缺点
1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA， 只能表达cDNA；
2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进 行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、 酰胺化等修饰作用；
蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从 而获得功能性分子 糖基化意义： 赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性
三、哺乳动物细胞表达特点
是表达哺乳动物基因（如人基因）的最好受体细 胞。
优点： 1、能识别和剪切内含子并加工为成熟的mRNA，既可表达
cDNA又可表达基因组DNA； 2、表达产物具有正确地高级结构和糖基化、磷酸化等修饰。 3、表达产物可分泌到培养液中，纯化容易。
缺点：
1、细胞生长慢，培养条件刻苛，大规模培养工艺 复杂、费用高