质粒测序引物

一、测序样品要求

一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。

菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。

若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。

3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。

PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。

2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。

3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。

不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。

4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。

5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。

6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。

二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。

addgene质粒鉴定方法

addgene质粒鉴定方法引言：质粒是一种环状的双链DNA分子，通常存在于细菌和酵母等微生物中。

它们被广泛用于基因工程和分子生物学研究，可用于构建重组DNA、表达外源蛋白和分析基因功能等。

然而，由于质粒本身存在多种变异和不同构象，在使用之前需要进行鉴定和验证，以确保所得数据的准确性和可靠性。

本文将介绍常用的addgene质粒鉴定方法。

一、限制性内切酶鉴定法限制性内切酶是一类能够识别并切割双链DNA特定序列的酶。

通过将质粒DNA与特定的限制性内切酶一起反应，可以得到特定长度的DNA片段。

根据这些DNA片段的大小及其模式，可以判断质粒的完整性和纯度。

1.扩增PCR方法该方法通过特定引物在质粒DNA上扩增目标序列，然后将PCR扩增产物与适当的限制性内切酶一起切割。

所得的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳分析，根据DNA片段的大小来鉴定质粒的完整性。

2.酶切方法该方法直接将质粒DNA与限制性内切酶反应，将产生的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，根据DNA片段的大小来鉴定质粒的完整性。

二、Sequencing鉴定法该方法通过对质粒DNA进行测序，确定其序列，并与已知的质粒序列进行比较，以鉴定质粒的准确性和纯度。

在测序过程中，还可以检测质粒序列上可能存在的突变或插入。

1. Sanger测序法Sanger测序法是一种常用的DNA测序技术，通过使用特定引物和荧光染料标记的特殊链终止核苷酸，可以得到质粒DNA的准确序列。

将得到的测序结果与已知的质粒序列进行比对分析，可以鉴定质粒的准确性和纯度。

2.高通量测序法高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是一种高效、高通量的测序技术。

通过对质粒DNA进行高通量测序，可以得到大量的测序数据，并通过对这些数据的比对和分析，来鉴定质粒的准确性和纯度。

三、温度敏感性鉴定法温度敏感质粒是一类能够在特定温度下被复制和维持，而在非特定温度下失去复制和维持能力的质粒。

质粒测序引物设计

质粒测序引物设计随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。

本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。

1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。

正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。

引物的主要特点有以下几个方面：（1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。

（2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。

（3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。

基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。

具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。

其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目标序列特异性扩增。

在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。

（2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。

一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。

（3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。

2. 引物设计流程在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下：（1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。

（2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。

一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。

DNA测序样品要求

附：测序样品的要求
一、PCR原液
∙片断通常大于200bp；
∙提供浓度大于50ng/ul，体积大于50ul；
∙2ul电泳检测条带清晰无杂带。

二、PCR已纯化
∙PCR产物溶于超纯水中；
∙浓度大于50ng/ul，体积大于20ul；
∙电泳检测条带单一。

三、质粒要求
∙质粒浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；
∙建议使用相关试剂盒提取；
∙建议同时提供1ml菌液；
∙大质粒需要注明载体长度。

四、菌液模板要求
∙说明载体的抗性，我们提供Amp 、kan、chl、tet四种抗生素；
∙对于低拷贝质粒请直接提供1ug纯化质粒；
∙提供1ml左右的过夜培养菌液，加15%灭菌甘油，于离心管中封口保存，防止交叉污染或泄漏；∙建议尽量提供穿刺培养的菌种。

五、引物要求
∙浓度5umol/l，体积大于20ul；
∙随机引物和兼并引物不适合测序；
∙尽可能提供引物全序列，PCR退火温度；
∙T7、SP6、M13(+)、M13(-)、T3等通用引物我们免费提供。

样品类型及注意事项。

质粒载体测序报告

质粒载体测序报告1. 引言质粒载体是一类广泛应用于分子生物学和基因工程研究的工具。

通过质粒载体，研究人员能够将外源基因导入到目标细胞中，实现基因的表达和功能分析。

质粒载体测序报告旨在对质粒载体进行全面的测序分析，以确定其序列信息，并评估其质量和适用性。

2. 实验流程质粒载体测序通常包括以下步骤：1.质粒提取：将质粒提取出来，通常采用离心、酚-氯仿提取或商用提取试剂盒等方法。

2.质粒纯化：通过离心、凝胶电泳等方法，将质粒与其他细胞成分分离。

3.质粒测序文库制备：将质粒线性化并连接适当的测序引物，反应后通过PCR扩增文库。

4.高通量测序：将质粒文库装入Illumina或其他测序平台中进行高通量测序。

5.数据分析：对测序数据进行质量控制、序列拼接和序列注释等分析。

3. 数据质量控制在质粒载体测序过程中，数据质量控制是必不可少的一步。

常见的数据质量控制指标包括测序错误率、Q值分布和序列长度分布等。

通过对质量较低的序列进行滤除或修剪，可以提高后续数据分析的精确性和准确性。

4. 序列拼接与注释在质粒测序后，通常需要对产生的序列进行拼接和注释以获取准确的质粒序列信息。

序列拼接主要通过比对软件如Bowtie、BLAST等将测序reads 结合在一起。

而序列注释则是通过比对测序 reads 到已知的数据库，如GenBank、NCBI等，以获得质粒中的潜在功能元件。

5. 结果和讨论通过对质粒载体测序的实验和数据分析，我们得到了以下结果：1.质粒载体序列：经过拼接和注释，我们获得了质粒载体的完整序列，长度为XXX bp。

2.质量评估：通过数据质量控制，我们对测序数据进行了过滤和修剪，确保了序列的准确性和可靠性。

3.序列注释：通过将测序 reads 比对到已知基因库，我们对质粒中的潜在功能元件进行了注释，包括启动子、终止子、转录因子结合位点等。

4.比对结果：我们将质粒序列与已知质粒库进行了比对，发现该质粒与已知质粒高度相似，符合预期。

质粒和PCR产物测序

DNA（质粒和PCR产物）测序操作程序一、P CR反应体系标准反应体系（20 μL）试剂用量DNA X μL（根据模板确定）BigDye 8 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积20 μL优化反应体系（10 μL）试剂用量DNA X μL （根据模板确定）BigDye 2 μL引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL灭菌去离子水补充到20 μL总体积10 μL测序PCR热循环条件：96 ︒C 1 min96 ︒C 10 se50 ︒C 5 sec x 25个循环60 ︒C 4 min4 ︒C保温二、测序产物纯化：10 μL反应体系，384孔板，酒精/EDTA/NaAc法1.每管加入1 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入1 μL 3M NaAc到管底。

2.每管加入25 μL 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min。

3.1400-2000 x g离心45 min 或者2000-3000 x g离心30 min，马上倒置384孔板，离心至185 x g 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。

4.每管加入35 μL 70% 酒精，1650 x g 4 ︒C离心15 min；马上倒置384孔板，离心至185 xg 停止离心（从离心机启动到达到185 x g停止离心总共1 min时间）。

5.重复第4步1次。

6.室温挥发净酒精，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4 ︒C保存。

7.溶解后的样品需要在 95 ︒C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。

三、测序产物纯化：单离心管法请参照20 μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法操作，只需要将“倒置96孔板，离心至185 x g 停止离心”这一操作改为用枪吸尽上清液。

1.每管加入2 μL 125 mM EDTA到管底，每管加入2 μL 3M NaAc到管底。

pACT2
GAL4 ADfor
pGAL4-ADrv
pACT2
p17110
p12584
pACYC184(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pACYCDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pACYCDuet-1(MCSII)
DuetUp2
T7-Terminator
M13R
pEASY-T3
M13F/T7
M13R/SP6
pECFP-N(C)
PECFP-N-5.
PECFP-N-3,
pEF/myc/cyto/ER/mito/nuc
pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/myc-His)
T7/pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/V5-His)
pDSRED-N1(KAN+)
pEGFP-N-5’
pDSRED-N-R
pEASY-Blunt
M13F
T7/ M13R
pEASY-BluntSimple
M13F
T7/ M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1 Simple
M13F
M13R（距离插入位点合适，优先安排）
pEASY-T1
M13F/T7
pBridge(MCSI)
GAL4-Bdfor
3'BD
pBridge(MCSII)
not available
not available
pBS-T II
T3/M13rev
T7/M13for

质粒测序引物设计

质粒测序引物设计
质粒测序是一种常用的分子生物学技术，用于分析质粒的基因组成和结构。

在质粒测序过程中，引物是至关重要的组成部分，其质量和设计直接影响到测序数据的准确性和可靠性。

因此，正确设计合适的引物至关重要。

设计引物的首要步骤是选择目标序列。

质粒测序通常需要分析全长或部分序列，因此需要确定目标序列的起止位置。

在选择目标序列时，还需要考虑序列的特点，如长度、GC含量和反向互补性等。

这些因素将影响引物的长度和特异性。

设计引物时，需要遵循一些基本原则。

首先，引物的长度应该在18-25个碱基对之间，以保证特异性和特异性。

其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物与目标序列的结合。

此外，还需要确保引物的特异性，以避免与其他序列的杂交信号。

引物设计时还需要考虑引物间的距离和方向。

引物之间的距离应该足够远，以避免重叠或杂交。

另外，正向和反向引物之间的距离应该相等，以确保扩增产物的长度均匀。

总之，正确设计引物对质粒测序的结果至关重要。

根据目标序列的特点，采用合适的引物设计策略和软件，可以设计出高质量的引物，从而获得更加准确和可靠的测序数据。

- 1 -。

构建质粒的基本步骤

（lnc2为例，lnc2分三段连接，GTP1、GTP2、GTP3(具体见文档“lncRNA4构建质粒的基本步骤：和lncRNA2的实验说明”中lnc2的部分)）基本流程：设计三个片段的引物（设计时注意载体pcDNA3.1的酶切位点）普通PCR 琼脂糖凝胶电泳后胶回收酶切电泳后胶回收酶连转化涂板挑单菌落（10管）摇菌提质粒酶切初步鉴定测序具体步骤：1、设计引物2、先将GTP1进行普通PCR(三个片段的模板分别为单独连接有该片段的质粒)，扩增条件聚合酶的说明书上有，50μl体系。

3、制胶（琼脂糖凝胶），将PCR产物全部上样，电泳（电泳液要新配置）45min左右后放紫外灯下，用干净刀片切出目的片段放置干净EP管，紫外灯每次照射时间不能太长。

4、用胶回收试剂盒回收，具体步骤见说明书。

5、胶回收后，用Nhe I，Kpn I两种酶将胶回收产物和载体pcDNA3.1进行双酶切5小时。

6、制胶，将酶切产物全部上样，跑电泳，胶回收（同步骤3、4）7、配酶连体系（见文档“分子生物学反应体系”），反应条件见连接酶说明书。

一般4℃过夜8、转化，（具体步骤见文档“分子生物学反应体系”）9、挑单菌落，10管，在加有氨苄的LB的试管中培养12~16h,37℃,140rpm.10、小提质粒（具体步骤见质粒提取试剂盒说明书）11、根据片段设计相关酶进行酶切鉴定，刷选出目的质粒，送去测序12、GTP1连上去后，GTP2、GTP3也与上述方法一样进行操作，只是GTP2的载体变为pcDNA3.1-- GTP1，GTP3的载体变为pcDNA3.1-- GTP1-- GTP2，同时相关的双酶切的酶也不同，GTP2片段时用Kpn I，BamHI。

GTP3片段时用BamHI，Xho I。

测序样品要求

一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。

菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。

若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。

3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。

PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。

2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。

3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。

不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。

4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。

5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。

6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。

二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。

测序常见问题分析

测序常见问题分析1.图谱无信号1.1、质粒培养，转化或其他随机原因使质粒上引物序列发生变化，导致无结合位点1.1.1同一模板两端引物测序均无信号，浓度不好安排重抽，反之停止实验，建议客户确认后重新送样1.1.2同一模只一端无信号，确认不是空载体，安排重新实验或换同序列其他引物，两次测序无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通。

反之建议客户单向测通1.1.3客户提供序列我司合成引物，二次实验仍无信号则停止实验，建议客户提供载体图谱或目的基因我处给他设计引物测序1.1.4客户提供序列我司设计并合成引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功则停止实验，请客户确认提供的序列是否和模板相匹配1.1.5我司设计并合成的步行引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功可重设引物或换另一端测通。

1.1.6某一通用引物测序无信号先查看当天该引物的其他实验或近期该引物的实验情况，均无信号则换管引物重新实验，当天该引物的其他实验有成功的，该反应重做1.1.7一订单多样品用同一对引物测序，某条引物测序均无信号，若为客户提供引物则停止实验。

若为通用引物有同序列其他引物，在确认不是空载载体的情况下，安排换引物试作三至四个反应，效果好全部安排用该引物测序；效果不好都停止实验。

客户要求测通的安排单向测通，反之建议单向测通。

1.1.8重摇重抽测序无信号则取消，建议重新提供样品1.1.9客户提供质粒直接测序无信号则停止实验，建议客户提供新鲜菌液1.1.10用PCR引物测序无信号可换备用引物测序，无备用引物停止实验，建议用载体上引物测序。

1.2、PCR 产物1.2.1同一模板两端引物测序均无信号则停止实验，建议客户克隆后测序1.2.2 同一模只一端无信号，安排重新实验, 仍无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通，反之建议步行测通2. 图谱信号弱可参考原始峰图，对不能出报告的峰图的处理如下：2.1 同一模板某一端，可安排提高浓度梯度重新实验2.2 某一模板或一订单多个模板中的一个模板2.2.1 鉴定浓度正常可安排提高浓度梯度重新实验，效果仍不好可作弱stop处理2.2.2 一次抽提出的质粒亮度弱，可安排重新抽提质粒后测序2.2.3 二次抽提出的质粒亮度弱，可停止实验，建议重新提供样品3 双峰3.1 PCR 产物测序3.1.1 引物不纯，引物客户提供该结果可出，引物我司合成安排重合引物3.1.2 引物特异性差，有双或多结合位点，可换备用引物测序，无备用引物即出结果3.1.3 polyT/A/G/C 出结果，单向建议客户换另一端测序。

全基因组测序质粒类型

全基因组测序质粒类型全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种高度精确的基因检测技术，通过对一个人的全基因组进行测序，可以揭示其遗传信息。

在基因测序过程中，质粒（Plasmid）作为载体发挥着至关重要的作用。

质粒是一种小型环状DNA分子，具有自主复制能力，可以携带外源基因并在受体细胞中进行表达。

因此，质粒在全基因组测序中扮演着关键角色，不同类型的质粒影响着测序的准确性和效率。

一、质粒类型概述目前，常用的全基因组测序质粒类型主要有两种：测序适配子（Sequencing Adapters）和测序引物（Sequencing Primers）。

1.测序适配子：测序适配子是连接测序仪器读取的片段与目标序列的一段短DNA片段。

在测序过程中，测序仪器读取的是测序适配子与目标序列相互连接的片段。

因此，测序适配子的选择对于全基因组测序的准确性至关重要。

2.测序引物：测序引物是用于引导DNA复制的短DNA片段。

在全基因组测序过程中，测序引物可以与目标序列上的特定区域相互结合，从而引导测序仪器读取目标序列。

引物的设计和选择会影响到测序的准确性和覆盖度。

二、全基因组测序质粒类型的选择与优化1.测序适配子的选择：为提高测序准确性，通常需要选择与目标序列匹配度高、GC含量适中、无重复序列的测序适配子。

此外，还需要考虑测序适配子的长度、硬度等因素，以保证在测序过程中能够稳定地连接目标序列。

2.测序引物的选择：优化测序引物设计是提高全基因组测序覆盖度和准确性的关键。

在选择测序引物时，应考虑以下因素：（1）引物长度：引物长度会影响到测序仪器的读取效果。

通常情况下，引物长度在10-20个碱基对之间为宜。

（2）引物Tm值：引物的Tm值（退火温度）会影响到引物与目标序列的结合效率。

Tm值过高或过低都会导致测序准确性下降，因此需要选择Tm值适中的引物。

（3）引物间的差异：为减少引物间的相互干扰，引物设计时应尽量选择具有较高特异性的引物，并确保引物间的序列差异足够大。

DNA测序常见问题解析

DNA测序常见问题解析一．引物问题Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？A：这里分以下几种情况：1. PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，而且刚刚开始的碱基由于在毛细管电泳中不能很好地分离而导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。

（1）对于较短的PCR产物（<600 bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。

（2）对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。

由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。

（3）由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。

2. 有时质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外源片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。

3. 找不到克隆片段的扩增引物。

发生这种情况原因有2个：（1）您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。

比如pBluescript Ⅱ KS这个质粒如果采用Sac I做工具酶，采用T7引物测序：那么从T7引物末端到 Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。

解决的办法是采用M13 Forward引物来测序，这样可以保证Sac I的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。

（2）您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的反向互补序列。

或者您插入的片段可能不是您的目的片段，而是由于非特异性扩增出来的片段，还有可能您送过来的样品被污染。

Q：测序发现引物有突变或缺失是什么原因？A：测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本身。

质粒构建流程

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）选择载体。

根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。

如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。

3）4℃，12000rpm离心10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。

质粒目的基因插入及引物设计流程

嵌套式引物设计
设计两对引物，其中一对引物位于另一对引物的内部，通过两轮PCR 反应提高扩增的特异性和灵敏度。
使用通用接头
在靶序列两端添加通用接头序列，然后针对接头序列设计通用引物进行PCR扩增。这种方法适用于多个不同靶序列的扩增。
04
实验操作流程详解
质粒提取与纯化方法
1 2
质粒提取
从含有目标质粒的细菌培养物中提取质粒，通常使用碱裂解法或煮沸法。
插入策略选择
01
根据实验需求和目的基因特点，选择合适的质粒载体和插入策略。
02
可采用定向克隆、同源重组或位点特异性重组等方法将目的基
因插入质粒。
插入策略需考虑质粒的稳定性、复制效率、表达水平及筛选方
03
法等因素。
03
引物设计原则与方法
引物设计基本原则
引物长度
通常引物长度为18-24个碱基，过长或过短都会影响PCR的特异性和效率。
将测序结果与已知的基因序列进行比对，检查插入的基因片段是否正确、完整。
验证结果
通过比对分析，验证质粒中是否成功插入了目的基因，并确认插入的位置和方向是否正确。
数据分析方法介绍
序列比对算法
利用BLAST等序列比对算法，将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，找出相似度高的序列。
统计分析方法
对测序结果进行统计分析，包括碱基组成、GC含量、重复序列等，以评估测序数据的质量和可靠性。
可视化工具
利用生物信息学可视化工具，如 IGV等，对测序结果进行可视化展示，方便直观地查看和分析数据。
06
实验注意事项与问题解决方案
实验操作规范及安全注意事项
严格遵守实验室安全规定，穿戴好实验服、手套和护目镜等防护用品。

一、测序样品要求

一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。

菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。

若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。

3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。

PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。

2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。

3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。

不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。

4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。

5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。

6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。

二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。

质粒的反向 pcr

质粒的反向 pcr质粒的反向PCR是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和确定质粒中目的基因的序列。

下面将详细介绍反向PCR的原理及步骤。

反向PCR是一种特殊的PCR方法，它与常规PCR的不同之处在于引物的设计。

在常规PCR中，引物是根据目的基因的已知序列设计的，用于扩增目的基因的片段。

而在反向PCR 中，引物则是根据已知的质粒序列设计的，用于扩增质粒中未知区域的片段。

反向PCR的原理基于以下几个假设：1) 质粒的已知序列和未知区域是相邻的；2) 扩增产物在PCR反应中会扩增未知区域的两侧序列。

反向PCR的步骤如下：1. DNA提取与限制性内切酶切割：首先，从含有目标质粒的菌株中提取质粒DNA。

接下来，用限制性内切酶切割质粒DNA，使未知区域与已知序列分开。

2. 偏移引物的设计：根据已知的质粒序列，设计一对偏移引物。

这对引物分别位于未知区域的两侧，并有适当的长度和碱基组成。

3. 反向PCR扩增：将切割后的质粒DNA作为模板，使用偏移引物进行反向PCR扩增。

PCR反应的条件包括合适的温度和时间参数，以确保目标序列的高效扩增。

4. 凝胶电泳和提取扩增产物：将反向PCR扩增后的产物进行凝胶电泳分离，通过电泳结果可以确定未知区域的大小和存在与否。

然后，从凝胶中提取目标产物，以便进一步分析和测序。

5. 序列分析：用测序方法对扩增产物进行测序，以确定未知区域的序列。

通过反向PCR技术，研究人员可以获取目标质粒中未知区域的序列信息。

这对于研究质粒功能以及质粒在基因克隆和表达中的应用具有重要意义。

总结起来，反向PCR是一种重要的质粒分析技术，通过设计合适的引物和PCR反应条件，可以扩增和测序未知区域的序列。

这种技术在基因克隆、质粒分析和分子生物学研究中具有广泛的应用前景。

质粒后续各项检测指标

质粒后续各项检测指标一、质粒检测的重要性质粒是一种环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等微生物中。

质粒具有自主复制和传递遗传信息的能力，因此在基因工程和分子生物学研究中被广泛应用。

在质粒应用前，必须对其进行各项检测指标的检测，以确保其质量和功能的完整性。

本文将从质粒含量、质粒完整性、质粒拷贝数以及质粒菌的筛选与鉴定等方面，进行全面、详细、完整且深入的探讨。

二、质粒含量的测定方法2.1 吸光度测定利用分光光度计，通过测量DNA在260nm波长下吸光度来估算质粒的含量。

吸光度测定是最常用的质粒含量测定方法，简便快捷，但只能提供DNA的大致含量，不能得到准确的质粒浓度。

2.2 脆性凝胶电泳脆性凝胶电泳是通过比较待测质粒与已知浓度DNA的带状图像的相对亮度，来估算质粒的含量。

该方法对质粒的线性范围较窄，对低浓度质粒的测定较不敏感。

2.3 荧光法利用DNA结合染料如PicoGreen或SYBR Green I等，结合荧光探测器来测定质粒的含量。

该方法对于高浓度质粒和低浓度质粒都有较好的线性检测范围，但需要专门的仪器和试剂。

三、质粒完整性的检测3.1 琼脂糖凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳可以直接观察到DNA断裂或降解的情况，从而判断质粒的完整性。

完整的质粒在凝胶上会显示为一个清晰的带状条带，而断裂或降解的质粒则呈现为模糊或多个条带。

3.2 PCR检测利用引物和DNA聚合酶，进行PCR扩增，可以检测质粒的完整性。

完整的质粒能够成功扩增出目标片段，而断裂或降解的质粒则不能。

3.3 限制性内切酶切割利用特定的限制性内切酶对质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳观察产生的酶切产物，可以判断质粒的完整性。

完整的质粒可以产生预期大小的酶切产物，而断裂或降解的质粒则无法或产生异常的酶切产物。

3.4 电泳迁移将不同完整性的质粒分别进行琼脂糖凝胶电泳，观察迁移的速度和距离。

完整的质粒迁移较慢，而断裂或降解的质粒迁移较快。

四、质粒拷贝数的测定方法4.1 实时荧光定量PCR利用特定引物和荧光探针，结合荧光定量PCR仪，可以定量测定质粒拷贝数。

质粒目的基因插入及引物设计流程

二. 登录/order/catalog/product/V652020?ICID=search-product 找到质粒的全序列
同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）
1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点，否则目的基因会被切掉；
https:///mol-bio-reference/genetic-code/
三.克隆引物设计 1. 电脑设计：回到NCBI的primer blast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)，在框中输入>|a|和CDS序列，并在Min 和Max分别输入1602（表示blast CDS全部基因）；
2. 质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：
选中目的基因列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1
在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：
一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）
1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 2. 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，则说明CDS序列稳定可用；
将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该段序列中的可能酶切位点
构建表达载体的一般流程：
设计primer(如上所述，综合考虑HA，CDS序列)→合成引物→选择合适的样本细胞（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取

质粒测序操作流程_简化

质粒测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备：（一）实验试剂：标准质粒，测序引物，Bigdye v3.1, ddH2O，POP7胶，Sequence Standard（3130），10 x Buffer，HiDi（二）实验耗材：96孔板，0.2EP管，移液枪，Centri-SEP纯化柱，计时器，记号笔二、实验操作具体步骤：（一）质粒测序反应体系（标准）：质粒（0.2ug/ul） 1 ul引物(0.8→3.2 pmol/ul) 4 ulBigDye(2.5x) 8 ulddH2O 7 ul总体积20 ul测序PCR循环条件:96 ℃1 min →(96 ℃10 sec →50 ℃5 sec →60 ℃4 min) x 25循环→4℃保温（二）测序产物纯化（Centri-SEP柱纯化）：1．水化离心柱（已提前制备好）2．去除间质液体2.1 打开离心柱的顶盖，然后去掉底部尾塞。

2.3 让离心柱中过量的液体在洗脱管（2ml EP管）中控干，弃去液体。

2.4 将离心柱和洗脱管一起离心（转速750g，2mins）去除间质中的液体。

2.5 大约能去除300ul液体。

如果离心柱底部有液滴，用纸吸干，弃去洗脱管和间质液体。

不要使凝胶过分干燥，即刻开始样品处理。

3．样品处理3.1 将离心柱置于光线充足地方。

将20ul测序产物混合液直接转移至凝胶顶端的正上方中心位置，注意不能碰到凝胶。

3.2 将离心柱放入样品收集管（1.5ml EP管），并置于离心机转子中。

保持原先的离心柱方向，将离心柱和样品收集管同时离心（转速750g，2mins）。

纯化的样品将被收集在样品收集管底部，弃去离心柱3.3 真空离心使样品干燥，不要使用加热法。

（三）测序标准品准备1．取一管低压冻干的Sequencing Standard，加入170ul Hi-Di重悬，混匀离心2. 取10ul至96孔板中（四）样品变性5ul纯化样品+ 5ul HiDi，混匀，至96孔板中，95℃2min变性，迅速放置于冰上，准备上机。