苯甲酸钠的毒物兴奋效应及其所致损害
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毒理学杂志 2010 年 8 月第 24 卷第 4 期 J Toxicol August 2010 Vol. 24 No. 4
中图分类号：R114 文献标识码：A 文章编号：1002 － 3127（2010）04 － 0300 － 04
·实验研究·
苯甲酸钠的毒物兴奋效应及其所致损害
邹志飞1 ，吴赤蓬2 ，郑立新3 ，陈永红1 （1. 广东出入境检验检疫局技术中心，广东 广州 510623； 2. 暨南大学医学院；3. 珠海出入境检验检疫局技术中心）
基金项目：广东省科技计划项目（2003C20419） ；广东出入检验 检 疫 局 科 技项目（2005GDK26） ；中国检科院资助项目（2009JK011）
作 者 简 介 ：邹 志 飞 ，硕 士 ，研 究 方 向 ：食 品 毒 理 学 。
研 究 ，现 报 告 如 下 。
1 材料与方法 1. 1 实验受体 中国仓鼠肺细胞 （ CHL，广 州 医 学 院 化学致癌研究所）。 1. 2 主 要 试 剂 SB （ AR 广 州 化 学 试 剂 厂 ） ，RPMI1640 培养基（ 美国 Gibco 公 司） ，胰 蛋 白 酶 （ 美 国 Difco 公司） ，新生牛血清（ 杭州四季青生物制品有限公 司 ） ， 噻唑蓝（ MTT，美国 Sigma 公 司 ） ，二 甲 亚 砜 （ DMSO，天 津大茂化学试 剂 厂 ） ，碘 丙 锭 （ PI，日 产 化 学 工 业 株 式 会社） ，丝裂霉素 C（ MMC，日本 Kyowa Hakko Kogyo 公 司） ，普通熔 点 琼 脂 糖 （ 西 班 牙 Biowese 公 司 ） ，低 熔 点 琼脂糖（ 美国 Gibco 公司） 。 1. 3 仪器 压力抽滤器（ 台湾 Nalgene 公司 ） ，二氧化 碳培养箱（ 法国 Jouan 公司） ，光学倒置显微镜（ 重庆奥 特光学仪器厂） ，DMR 荧光显微 镜 （ 德 国 Leica 公 司） ， Mk3 酶标仪（ Thermo Labsystem，Finland） ，96 孔 及 6 孔 培养板（ 康宁公司） ，DYY-7C 型电泳仪（ 北京六一仪器 厂） ，ELIPE 型 流 式 细 胞 分 析 仪 （ 美 国 COULPER 公 司） ，单细胞电泳毛面玻片（ 本室以载玻片打磨加工） 。 1. 4 方 法 MTT 法 测 定 细 胞 增 殖 率、单 细 胞 凝 胶 电 泳 （ SCGE ） 、细 胞 周 期 与 凋 亡 分 析 按 照 邹 志 飞 等［4］采 用的 方 法 进 行。 实 验 设 0. 002、0. 014、0. 086、0. 514、 3. 086、18. 519、111. 111、666. 667 和 4000. 000 mg / L 9 个剂量组，1 个试剂空白对照组。
【关键词】 苯甲酸钠；毒性；Hormesis；细胞增殖；DNA 损伤
苯甲酸钠 （ Sodium benzoate，SB ） 是 一 种 长 期 广 泛 使用的食 品 防 腐 剂，每 日 允 许 摄 入 量 （ ADI ） 为 0 ～ 5 mg / kg，我国 允 许 最 大 使 用 量 以 苯 甲 酸 计 为 0. 2 ～ 1. 5 g / kg。SB 能干扰霉菌和细菌细胞膜的通透 性，阻 碍 对 氨基酸吸收，消耗细 胞 内 的 储 碱，抑 制 呼 吸 酶 活 力，对 各种真菌和部分细 菌 产 生 抑 制 作 用。 已 有 报 道，过 量 摄入 SB 可 能 引 起 流 涎、腹 泻、腹 痛 和 心 跳 加 快 等 症 状 ，并 有 一 定 的 蓄 积 毒 性 。 猫 对 苯 甲 酸 敏 感 ，表 现 为 神 经过敏、兴奋、平衡 和 视 力 丧 失。 研 究 发 现 SB 有 对 小 鼠骨髓细胞染色体的 断 裂 效 应 及 纺 锤 体 毒 效 应，引 起 染色体断裂［1-2］。引起 细 胞 形 态 及 细 胞 膜 发 生 明 显 改 变。Tsay 等［3］发现 SB 对斑马鱼 胚 胎 有 神 经 毒 性 和 前 肾毒性。近 年 来，毒 物 低 剂 量 兴 奋 效 应 （ Hormesis） 现 象在毒理学领域广受 关 注，也 使 统 治 毒 理 学 长 达 近 一 个世纪之久的阈值量效模型受到了挑战。美国环境保 护局（ EPA） 在评价物 质 致 癌 性 时，已 开 始 考 虑 低 剂 量 物质的兴奋效应。部分学者认为 hormesis 广泛存在于 不 同 种 属 、不 同 结 构 的 化 学 物 以 及 各 种 生 命 终 点 ，具 有 普遍性［4］。为了 了 解 SB 在 阈 剂 量 以 外 的 毒 性 特 征， 该试验对 SB 的 Hormesis 以 及 在 低 剂 量 兴 奋 效 应 带 （ Hormetic Zone） 剂量范围的生物学效应及损害进行了
图 1 苯甲酸钠的剂量改变与 CHL 细胞增殖率变化
根据 Calabrese 和 Baldwin［5］的 Hormesis 识别 要 求 与判断标准，对 本 试 验 中 SB 的 Hormesis 的 证 据 级 别 进行累积积分，反映 SB 有 Hormesis 的 证 据 为 中 级，见 表 1。
注：与空白对照比较，a P < 0. 05 ；与空白对照比较，b P < 0. 01 。
625. 000 2 500. 000 5 000. 000 MMC（5 mg/L）
108 2. 20 ± 3. 30 0. 14 ± 0. 23 7. 48 ± 10. 43 0. 59 ± 1. 08 107 3. 16 ± 2. 27b 0. 18 ± 0. 14b 11. 37 ± 8. 46b 0. 89 ± 0. 72b 103 4. 24 ± 3. 71b 0. 24 ± 0. 21b 13. 13 ± 10. 87b 1. 06 ± 0. 92b 102 5. 57 ± 4. 48b 0. 36 ± 0. 45b 20. 70 ± 16. 44b 1. 85 ± 1. 83b
表 1 根据苯甲酸钠的兴奋效应证据确定级别
化学物质
是否确定 没有观察 到的效应 水平 （ NOEL）
ຫໍສະໝຸດ Baidu
低于 NOEL 组数
统计 意义 组数
效应强 重 复
合计
度
次数
兴奋效应证 据的级别
实验设计评价
是
2
2 < 110% 有 —
—
得分
1
5
4
0
8 13
中
2. 2 细胞 DNA 损伤 SB 在 0. 004 ～ 5 000. 000 mg / L 的多个剂量组均引起 CHL 细 胞 DNA 损伤。在 SB 产 生 Hormesis 的 0. 514 ～ 666. 667 mg / L 剂 量 范 围 （ Hormetic Zone ） ，19. 531，78. 125 和 156. 250 mg / L 3 个剂量组 SCGE 的 细 胞 核 尾 长 （ μm ） 、尾 长 / 头 长、尾
表 2 苯甲酸钠对 CHL 细胞的遗传损伤
剂量 （ mg / L）
尾长
细胞数 （ μm）
尾 /头（ 长） 尾 DNA% Olive 尾矩
0
103 1. 38 ± 2. 09 0. 07 ± 0. 11 3. 87 ± 6. 63 0. 31 ± 0. 64
0. 004
103 1. 14 ± 1. 72 0. 07 ± 0. 10 5. 05 ± 6. 64 0. 27 ± 0. 41
毒理学杂志 2010 年 8 月第 24 卷第 4 期 J Toxicol August 2010 Vol. 24 No. 4
·301·
1. 5 统 计 学 方 法 统 计 分 析 采 用 SPSS16. 0 分 析 软 件，单因素方差分析 法 分 析 各 剂 量 组 与 对 照 组 的 试 验 指标差别是否有统计学意义，检验水准 α = 0. 05。
2 结果 2. 1 细胞的增殖率 以试剂空白对照组的细胞增殖 率为 100% ，换 算 各 剂 量 组 的 相 对 细 胞 增 殖 率。 当 剂 量由 0. 002 mg / L 逐渐增大时细胞的增殖率逐渐增加。 在 0. 514 ～ 666. 667 mg / L 剂 量 范 围，随 剂 量 增 加 细 胞 增殖率变 化 呈 一 拖 尾 很 长 的 抛 物 线 分 布。 当 增 大 到 4 000. 000 mg / L时，细胞增率 受 到 明 显 抑 制。 根 据 SB 浓度 与 细 胞 增 殖 率 变 化，可 确 定 SB 存 在 Hormesis， Hormetic Zone 剂量范围为 0. 514 ～ 666. 667 mg / L。在 该效应带内，18. 519 和 111. 111 mg / L 2 个剂量组与试 剂空白比较，差 异 有 统 计 学 意 义 （ P < 0. 01 ） 。 其 中 以 111. 111 mg / L 的作用最为明显，细 胞 增 殖 率 是 空 白 对 照组的 104. 58 % （ 图 1） 。
0. 391
125 1. 38 ± 2. 91 0. 10 ± 0. 26 5. 33 ± 10. 26 0. 42 ± 1. 05
3. 906 19. 531 78. 125 156. 250
106 2. 01 ± 3. 89 0. 14 ± 0. 30 7. 73 ± 14. 41 0. 59 ± 1. 33 103 2. 87 ± 4. 20b 0. 19 ± 0. 35b 10. 41 ± 14. 80a 0. 76 ± 1. 23b 108 4. 95 ± 3. 89b 0. 33 ± 0. 35b 19. 15 ± 15. 91b 1. 45 ± 1. 30b 119 2. 71 ± 3. 42a 0. 18 ± 0. 28b 10. 06 ± 12. 94b 0. 74 ± 1. 06a
DNA% 、Olive 尾矩与 空 白 对 照 组 比 较，差 异 有 统 计 学 意义（ P < 0. 05 ） ，其 中 以 78. 125 mg / L 剂 量 组 损 伤 尤 其明 显，与 MTT 检 测 的 细 胞 增 殖 率 最 高 的 剂 量 111. 111 mg / L 较接近（ 表 2） 。
【摘要】 目的 了解苯甲酸钠（ Sodium benzoate，SB） 是 否 存 在 低 剂 量 兴 奋 效 应 （ Hormesis） 以 及 在 低 剂 量 兴 奋 效 应 带（ Hormetic Zone） 剂量范围 的 损 害 特 性。 方 法 采 用 噻 唑 蓝 （ MTT ） 比 色 法、单 细 胞 凝 胶 电 泳 （ SCGE ） 和 流 式 细 胞 术 （ FCM） ，观察经 SB 处理后的体外培养 CHL 细胞增殖 率，判 断 是 否 存 在 Hormesis；观 察 SB 处 理 后 的 体 外 培 养 CHL 细 胞 DNA 损害，细胞周期与凋亡率改变，判断在 Hormetic Zone 剂量范围的损害特性。结果 SB 使体外培养 CHL 细胞增殖率 增加，Hormetic Zone 的 剂 量 范 围 为 0. 514 ～ 666. 667 mg / L，以 111. 111 mg / L 的 细 胞 增 殖 率 最 高，为 空 白 对 照 组 的 104. 58% ；SB 引起体外培养 CHL 细胞 DNA 损伤，19. 531，78. 125 和 156. 25 mg / L 3 个剂量组 SCGE 的细胞核尾长、尾长 / 头 长、尾 DNA% 、Olive 尾矩与空白对照组比较差别有统计学意义；SB 在 0. 391 ～ 156. 250 mg / L 引起 G0 / G1 期细胞数比例 增加，而 G2 / M 期和 S 期细胞数比例相应减少；SB 在 0. 391 ～ 625. 000 mg / L 引起 CHL 细胞凋亡率均 较 空 白 对 照 组 下 降 。 结论 在该试验条件下，SB 存在 Hormesis，在 Hormetic Zone 剂量范 围 引 起 DNA 损 伤 等 生 物 学 效 应，对 这 种 效 应 的 利 弊 应审慎评价。
毒理学杂志 2010 年 8 月第 24 卷第 4 期 J Toxicol August 2010 Vol. 24 No. 4
中图分类号：R114 文献标识码：A 文章编号：1002 － 3127（2010）04 － 0300 － 04
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苯甲酸钠的毒物兴奋效应及其所致损害
邹志飞1 ，吴赤蓬2 ，郑立新3 ，陈永红1 （1. 广东出入境检验检疫局技术中心，广东 广州 510623； 2. 暨南大学医学院；3. 珠海出入境检验检疫局技术中心）
基金项目：广东省科技计划项目（2003C20419） ；广东出入检验 检 疫 局 科 技项目（2005GDK26） ；中国检科院资助项目（2009JK011）
作 者 简 介 ：邹 志 飞 ，硕 士 ，研 究 方 向 ：食 品 毒 理 学 。
研 究 ，现 报 告 如 下 。
1 材料与方法 1. 1 实验受体 中国仓鼠肺细胞 （ CHL，广 州 医 学 院 化学致癌研究所）。 1. 2 主 要 试 剂 SB （ AR 广 州 化 学 试 剂 厂 ） ，RPMI1640 培养基（ 美国 Gibco 公 司） ，胰 蛋 白 酶 （ 美 国 Difco 公司） ，新生牛血清（ 杭州四季青生物制品有限公 司 ） ， 噻唑蓝（ MTT，美国 Sigma 公 司 ） ，二 甲 亚 砜 （ DMSO，天 津大茂化学试 剂 厂 ） ，碘 丙 锭 （ PI，日 产 化 学 工 业 株 式 会社） ，丝裂霉素 C（ MMC，日本 Kyowa Hakko Kogyo 公 司） ，普通熔 点 琼 脂 糖 （ 西 班 牙 Biowese 公 司 ） ，低 熔 点 琼脂糖（ 美国 Gibco 公司） 。 1. 3 仪器 压力抽滤器（ 台湾 Nalgene 公司 ） ，二氧化 碳培养箱（ 法国 Jouan 公司） ，光学倒置显微镜（ 重庆奥 特光学仪器厂） ，DMR 荧光显微 镜 （ 德 国 Leica 公 司） ， Mk3 酶标仪（ Thermo Labsystem，Finland） ，96 孔 及 6 孔 培养板（ 康宁公司） ，DYY-7C 型电泳仪（ 北京六一仪器 厂） ，ELIPE 型 流 式 细 胞 分 析 仪 （ 美 国 COULPER 公 司） ，单细胞电泳毛面玻片（ 本室以载玻片打磨加工） 。 1. 4 方 法 MTT 法 测 定 细 胞 增 殖 率、单 细 胞 凝 胶 电 泳 （ SCGE ） 、细 胞 周 期 与 凋 亡 分 析 按 照 邹 志 飞 等［4］采 用的 方 法 进 行。 实 验 设 0. 002、0. 014、0. 086、0. 514、 3. 086、18. 519、111. 111、666. 667 和 4000. 000 mg / L 9 个剂量组，1 个试剂空白对照组。
【关键词】 苯甲酸钠；毒性；Hormesis；细胞增殖；DNA 损伤
苯甲酸钠 （ Sodium benzoate，SB ） 是 一 种 长 期 广 泛 使用的食 品 防 腐 剂，每 日 允 许 摄 入 量 （ ADI ） 为 0 ～ 5 mg / kg，我国 允 许 最 大 使 用 量 以 苯 甲 酸 计 为 0. 2 ～ 1. 5 g / kg。SB 能干扰霉菌和细菌细胞膜的通透 性，阻 碍 对 氨基酸吸收，消耗细 胞 内 的 储 碱，抑 制 呼 吸 酶 活 力，对 各种真菌和部分细 菌 产 生 抑 制 作 用。 已 有 报 道，过 量 摄入 SB 可 能 引 起 流 涎、腹 泻、腹 痛 和 心 跳 加 快 等 症 状 ，并 有 一 定 的 蓄 积 毒 性 。 猫 对 苯 甲 酸 敏 感 ，表 现 为 神 经过敏、兴奋、平衡 和 视 力 丧 失。 研 究 发 现 SB 有 对 小 鼠骨髓细胞染色体的 断 裂 效 应 及 纺 锤 体 毒 效 应，引 起 染色体断裂［1-2］。引起 细 胞 形 态 及 细 胞 膜 发 生 明 显 改 变。Tsay 等［3］发现 SB 对斑马鱼 胚 胎 有 神 经 毒 性 和 前 肾毒性。近 年 来，毒 物 低 剂 量 兴 奋 效 应 （ Hormesis） 现 象在毒理学领域广受 关 注，也 使 统 治 毒 理 学 长 达 近 一 个世纪之久的阈值量效模型受到了挑战。美国环境保 护局（ EPA） 在评价物 质 致 癌 性 时，已 开 始 考 虑 低 剂 量 物质的兴奋效应。部分学者认为 hormesis 广泛存在于 不 同 种 属 、不 同 结 构 的 化 学 物 以 及 各 种 生 命 终 点 ，具 有 普遍性［4］。为了 了 解 SB 在 阈 剂 量 以 外 的 毒 性 特 征， 该试验对 SB 的 Hormesis 以 及 在 低 剂 量 兴 奋 效 应 带 （ Hormetic Zone） 剂量范围的生物学效应及损害进行了
图 1 苯甲酸钠的剂量改变与 CHL 细胞增殖率变化
根据 Calabrese 和 Baldwin［5］的 Hormesis 识别 要 求 与判断标准，对 本 试 验 中 SB 的 Hormesis 的 证 据 级 别 进行累积积分，反映 SB 有 Hormesis 的 证 据 为 中 级，见 表 1。
注：与空白对照比较，a P < 0. 05 ；与空白对照比较，b P < 0. 01 。
625. 000 2 500. 000 5 000. 000 MMC（5 mg/L）
108 2. 20 ± 3. 30 0. 14 ± 0. 23 7. 48 ± 10. 43 0. 59 ± 1. 08 107 3. 16 ± 2. 27b 0. 18 ± 0. 14b 11. 37 ± 8. 46b 0. 89 ± 0. 72b 103 4. 24 ± 3. 71b 0. 24 ± 0. 21b 13. 13 ± 10. 87b 1. 06 ± 0. 92b 102 5. 57 ± 4. 48b 0. 36 ± 0. 45b 20. 70 ± 16. 44b 1. 85 ± 1. 83b
表 1 根据苯甲酸钠的兴奋效应证据确定级别
化学物质
是否确定 没有观察 到的效应 水平 （ NOEL）
ຫໍສະໝຸດ Baidu
低于 NOEL 组数
统计 意义 组数
效应强 重 复
合计
度
次数
兴奋效应证 据的级别
实验设计评价
是
2
2 < 110% 有 —
—
得分
1
5
4
0
8 13
中
2. 2 细胞 DNA 损伤 SB 在 0. 004 ～ 5 000. 000 mg / L 的多个剂量组均引起 CHL 细 胞 DNA 损伤。在 SB 产 生 Hormesis 的 0. 514 ～ 666. 667 mg / L 剂 量 范 围 （ Hormetic Zone ） ，19. 531，78. 125 和 156. 250 mg / L 3 个剂量组 SCGE 的 细 胞 核 尾 长 （ μm ） 、尾 长 / 头 长、尾
表 2 苯甲酸钠对 CHL 细胞的遗传损伤
剂量 （ mg / L）
尾长
细胞数 （ μm）
尾 /头（ 长） 尾 DNA% Olive 尾矩
0
103 1. 38 ± 2. 09 0. 07 ± 0. 11 3. 87 ± 6. 63 0. 31 ± 0. 64
0. 004
103 1. 14 ± 1. 72 0. 07 ± 0. 10 5. 05 ± 6. 64 0. 27 ± 0. 41
毒理学杂志 2010 年 8 月第 24 卷第 4 期 J Toxicol August 2010 Vol. 24 No. 4
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1. 5 统 计 学 方 法 统 计 分 析 采 用 SPSS16. 0 分 析 软 件，单因素方差分析 法 分 析 各 剂 量 组 与 对 照 组 的 试 验 指标差别是否有统计学意义，检验水准 α = 0. 05。
2 结果 2. 1 细胞的增殖率 以试剂空白对照组的细胞增殖 率为 100% ，换 算 各 剂 量 组 的 相 对 细 胞 增 殖 率。 当 剂 量由 0. 002 mg / L 逐渐增大时细胞的增殖率逐渐增加。 在 0. 514 ～ 666. 667 mg / L 剂 量 范 围，随 剂 量 增 加 细 胞 增殖率变 化 呈 一 拖 尾 很 长 的 抛 物 线 分 布。 当 增 大 到 4 000. 000 mg / L时，细胞增率 受 到 明 显 抑 制。 根 据 SB 浓度 与 细 胞 增 殖 率 变 化，可 确 定 SB 存 在 Hormesis， Hormetic Zone 剂量范围为 0. 514 ～ 666. 667 mg / L。在 该效应带内，18. 519 和 111. 111 mg / L 2 个剂量组与试 剂空白比较，差 异 有 统 计 学 意 义 （ P < 0. 01 ） 。 其 中 以 111. 111 mg / L 的作用最为明显，细 胞 增 殖 率 是 空 白 对 照组的 104. 58 % （ 图 1） 。
0. 391
125 1. 38 ± 2. 91 0. 10 ± 0. 26 5. 33 ± 10. 26 0. 42 ± 1. 05
3. 906 19. 531 78. 125 156. 250
106 2. 01 ± 3. 89 0. 14 ± 0. 30 7. 73 ± 14. 41 0. 59 ± 1. 33 103 2. 87 ± 4. 20b 0. 19 ± 0. 35b 10. 41 ± 14. 80a 0. 76 ± 1. 23b 108 4. 95 ± 3. 89b 0. 33 ± 0. 35b 19. 15 ± 15. 91b 1. 45 ± 1. 30b 119 2. 71 ± 3. 42a 0. 18 ± 0. 28b 10. 06 ± 12. 94b 0. 74 ± 1. 06a
DNA% 、Olive 尾矩与 空 白 对 照 组 比 较，差 异 有 统 计 学 意义（ P < 0. 05 ） ，其 中 以 78. 125 mg / L 剂 量 组 损 伤 尤 其明 显，与 MTT 检 测 的 细 胞 增 殖 率 最 高 的 剂 量 111. 111 mg / L 较接近（ 表 2） 。
【摘要】 目的 了解苯甲酸钠（ Sodium benzoate，SB） 是 否 存 在 低 剂 量 兴 奋 效 应 （ Hormesis） 以 及 在 低 剂 量 兴 奋 效 应 带（ Hormetic Zone） 剂量范围 的 损 害 特 性。 方 法 采 用 噻 唑 蓝 （ MTT ） 比 色 法、单 细 胞 凝 胶 电 泳 （ SCGE ） 和 流 式 细 胞 术 （ FCM） ，观察经 SB 处理后的体外培养 CHL 细胞增殖 率，判 断 是 否 存 在 Hormesis；观 察 SB 处 理 后 的 体 外 培 养 CHL 细 胞 DNA 损害，细胞周期与凋亡率改变，判断在 Hormetic Zone 剂量范围的损害特性。结果 SB 使体外培养 CHL 细胞增殖率 增加，Hormetic Zone 的 剂 量 范 围 为 0. 514 ～ 666. 667 mg / L，以 111. 111 mg / L 的 细 胞 增 殖 率 最 高，为 空 白 对 照 组 的 104. 58% ；SB 引起体外培养 CHL 细胞 DNA 损伤，19. 531，78. 125 和 156. 25 mg / L 3 个剂量组 SCGE 的细胞核尾长、尾长 / 头 长、尾 DNA% 、Olive 尾矩与空白对照组比较差别有统计学意义；SB 在 0. 391 ～ 156. 250 mg / L 引起 G0 / G1 期细胞数比例 增加，而 G2 / M 期和 S 期细胞数比例相应减少；SB 在 0. 391 ～ 625. 000 mg / L 引起 CHL 细胞凋亡率均 较 空 白 对 照 组 下 降 。 结论 在该试验条件下，SB 存在 Hormesis，在 Hormetic Zone 剂量范 围 引 起 DNA 损 伤 等 生 物 学 效 应，对 这 种 效 应 的 利 弊 应审慎评价。