目的基因的连接转化refresh.
实验四 连接及转化
2.ＤＮＡ分子的体外重组 ＤＮＡ分子的体外重组 ＤＮＡ
• ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶 催化两个双链ＤＮＡ片段相邻的５’端磷酸与３’端羟基之 间形成磷酸二酯键的生物化学过程.
ＤＮＡ连接酶
常用的DNA连 接酶有两种： (1)来自大肠 杆菌的DNA连 接酶 (2)来自噬菌 体的T4 DNA连 接酶。
实验四:目的 的连接、 实验四 目的基因的连接、转化 目的 的连接
实验目的及背景
• 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克 当我们已经获得目的基因片段， 或表达，转化）质粒载体， 隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方 案后，下面要进行的就是ＤＮＡ ＤＮＡ片段之间的体外 案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外 连接，从而获得重组子。 连接，从而获得重组子。 • 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因 的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物 的扩增以及目的基因表达（ 的生产）， ），还可用于序列分析和转基因等重要生 的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生 物技术的研究中。 物技术的研究中。
本实验连接材料及连接体系
连接体系
载体DNA 目的DNA 双蒸水 连接反应液（2×） 总体积 50 ng 19 ng 0.5ul ? ul ? ul 5ul 10ul
5ul
用加样器柔和吹打混匀,16℃连接2小时。
附注：载体和目的基因的摩尔比为1:3 附注：载体和目的基因的摩尔比为 50ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb 6.3ng*3=19ng
本次课程的实验内容：
1. 目的基因浓度测定 2. 线性化载体和目的基因体外重组 3. 感受态大肠杆菌的制备 4. 重组子的转化 5. 转化大肠杆菌的培养
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定一、实验目的1.CaCl2法制备感受态细胞2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH>12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂1.器材恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂1)用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA (20 ng/ul)2)用BamH I 和Xba I 处理的4.8 kb c-myc DNA 片段(20 ng/ul)3)已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA (5 ng/ul)4)T4 DNA连接酶(5 U/ul)及10X连接酶缓冲液(Thermo公司)5)LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板(含抗生素)6)0.1 mol/L CaCl/溶液7)AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen公司产品)8)无水乙醇9)BamH I (10 ug/ul)及Xbal I (10 ug/ul) (NEB 公司产品)10)10X Buffer 4 (NEB 公司产品)11)1X TAE ( 0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA)12)Y DNA Hind III Markers (0.1 ug/ul) (Thermo 公司)13)6X凝胶加样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40% (w/v)蔗糖水溶液)14)氨苄青霉素储存液(100 mg/ml)15)CelRed 核酸染料(10000X in water) (Biotium 公司产品) 四、实验步骤1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接目的基因片段(4.8 kb)，25 ng/ul 4 ul载体DNA (3.5 kb), 25 ng/ul 4 ul10X buffer 1 ulT4 DNA 连接酶(5 U/ul) 0.5 ulddH2O 0.5 ul总体积：10 ul 混匀，16℃水浴锅温浴2. CaCl 法制备感受态细胞21)取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h,细胞长至云雾状。
转化连接实验报告
一、实验目的1. 了解转化连接的原理和过程；2. 掌握转化连接的操作步骤；3. 学习检测转化连接结果的方法。
二、实验原理转化连接是指将目的基因与载体连接，并将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因的过程。
转化连接包括DNA连接和转化两个步骤。
1. DNA连接：利用DNA连接酶将目的基因与载体连接，形成重组质粒。
DNA连接酶能够催化两个DNA分子的末端以磷酸二酯键相连，形成完整的DNA分子。
2. 转化：将重组质粒导入受体细胞中，使其在受体细胞内表达目的基因。
转化方法有多种，如电转化、化学转化等。
三、实验材料1. 试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、dNTPs、DNA分子量标准、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳试剂等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计、离心机、移液器等；3. 培养基：LB培养基、氨苄西林等。
四、实验步骤1. 目的基因和载体的制备：利用限制性内切酶分别切割目的基因和载体，获得具有相同黏性末端的DNA片段。
2. DNA连接：将目的基因和载体片段按照一定比例混合，加入DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和dNTPs，在适当的温度下进行连接反应。
3. 重组质粒的制备：将连接反应产物进行PCR扩增，获得目的基因和载体的重组质粒。
4. 重组质粒的鉴定：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察重组质粒的分子量是否与预期相符。
5. 转化：将重组质粒转化至受体细胞中，如大肠杆菌。
常用的转化方法有电转化、化学转化等。
6. 转化细胞的培养：将转化后的细胞在含有氨苄西林的LB培养基中培养，以便筛选含有重组质粒的转化细胞。
7. 阳性克隆的筛选：通过PCR或DNA测序等方法，检测转化细胞中是否含有目的基因，筛选出阳性克隆。
五、实验结果与分析1. 重组质粒的制备：通过PCR扩增获得重组质粒，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR 产物与预期分子量相符。
2. 转化细胞培养：在含有氨苄西林的LB培养基中培养转化细胞，观察细胞生长情况。
目的基因的连接与转化
转化示意图
连接效率的计算
连接效率=
转化子数 ×转化效率×100% 载体质量
(个/ ng) (个/ ng)
2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连
接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16 小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用 于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而 不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。
感受态细胞的制备
Hanahan法是制备高效感受态细菌的标准方法。 这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到 109 cfu/µg DNA。 注：1.低温培养，18℃培养至OD600约为0.5； 2.超净台无菌操作，低温操作； 3.标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不 同，不同质粒形态转化率也不相同。
1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可 为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度 和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要 作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体 积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。
转化原理
1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶
结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成
了大肠杆菌人工诱导的感受态； 2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷 酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 3. 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之 出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的 存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌 株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。二甲基亚砜（DMSO）和二巯 基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，大大提高了大 肠杆菌的转化效率。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
实验三 目的基因的连接、转化
水浴摇床
收集菌体
4. 取1ml 菌液冰浴5min，6000rpm离心5 min；
5. 弃上清，除净剩余液体，轻轻弹匀菌体沉淀，加入 100μl 冰冷的100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰 浴5分钟；
6. 6000rpm离心5min后，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，
2. 如何估计DNA的含量？（DNA marker 参比法）
电泳样本：Marker 50ng/5μl、T载体1μl、回收片段 电泳后通过电泳样品的亮度，估算连接片段和载体的比例
二、PCR产物与T载体的连接
T载体一般从公司购买，载体DNA的含量和浓度已知。 因此，连接反应成败的关键是估计目的DNA的量。
M
三、感受态细胞的制备
感受态细胞的制备原理
培养至对数生长期的大肠杆菌，在低渗 CaCl2 存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因 的导入。 钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄取能力 增强。
注意事项：
1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。
如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞 膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通 细胞状态，失去接受外源DNA的能力。
公司及产品：
1、Invitrogen公司的Lipofectamine； 2、Promega的一系列阳离子转移剂：TransFast™，
Transfection Reagent， Tfx™ Reagents和 Transfectam® Reagent.
磷酸钙转染技术
原理：
磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合， 形成磷酸钙沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细 胞质。
2、生物制药、基因治疗
目的基因的连接与转化课件精美版
分子量 100,000
温度 37 ℃
最适PH10.0附近（高底 物浓度）PH 8.0附近（低底
物浓度）
65℃30分钟处理99％ 的活性不可逆失活，随 具体条件改变有变动， 完全失活苯酚处理
本实验连接材料及连接 体系
连接示意图
连接体系
载体DNA 目的DNA 连接缓冲液（5×）
用蒸馏水稀释至6ul
转化示意图
每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。
Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。 标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不同，不同质粒形态转化率也不相同。
0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区 域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；
温 超度净台60无2℃菌. —操进6作5行，℃低连温操接作反； 应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连
℃ ℃ ℃ Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。
温度 60 ℃ —接65在℃ 22 保温4-16小时，粘性末端在22 保温3小时，或16 保温
实验三 目的基因的连接、转化
1、转化时一般要加一定量的巯基乙醇或 DMSO，其作用是防止细胞被胀破。
2、10 l连接产物可以进行2-3 次转化。
3、热休克作用原理 Ca2+诱导大肠杆菌成为感受态细胞， 感受态细胞经热休克（42oC，45～90 s） 发生收缩作用，使细胞膜出现空隙， 有利于外源基因的导入。
一、 PCR产物的回收
常见的回收方法：
1、冻融法：
1）在UV灯下，用手术刀片切下含DNA片段的琼脂 糖凝胶，-70oC冷冻至少15min；
2）在65oC水浴中使胶融化，加入等倍体积TE-饱合 酚，剧烈振荡30s，-70oC冷冻15min；
3）室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水相 移至另一管中，2.5倍体积乙醇、0.1倍体积 3mol/L NaAc沉淀、漂洗和干燥DNA。
可按下列配方进行连接反应：
回收的PCR产物（DNA片段） T载体 T4 DNA 连接酶buffer
T4 DNA ligase
7 l 1 l 1 l 1 l
终体积
10 l
轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1h。
连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。
TA克隆原理
1、TaqDNA聚合酶：PCR产物的3`端突出一个A
实验三 目的基因的连接、转化
转化——
将（重组）DNA分子导入原核细胞的 过程。
本次实验是将重组T载体导入大肠杆菌。
实验三.目的基因的连接、转化
实验内容
1. PCR产物的回收； 2. 连接反应； 3. 感受态细胞的制备； 4. 铺制LB培养平板； 5. 连接产物的转化； 6. 涂板筛选转化成功的大肠杆菌。
2 、挤胶法
（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的 琼脂糖凝胶切下，放入小离心管中；
目的基因的连接、转化、涂板培养ppt
感2.受态质细胞粒分的装成质10量0μ和l的小浓份度,暂:且不用用的于贮转存于化-7的0℃质可保粒存D半N年A。应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情
细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时
)p,M并D用T况超M1纯下8水-T,配DV制eNc,At最o溶r好分液装的保0.存体于积干燥不的应冷暗超处。过感受态细胞体积的5％。
转---转入宿主细胞
感受态细胞 感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化
学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成 为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
实验原理 ---CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细 菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时 处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌 膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA 酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作 用促进细胞对DNA的吸收。
当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（称为α互补），产生具有酶活
性的蛋白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG（强诱导剂）,X-gal（生色底物）的培养基上呈蓝色。
取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.
目的
掌握目的基因的重组连接原理及方法。 理解蓝白斑筛选鉴定的原理 熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路
和方法
实验总设计
分---PCR分离目的基因 切 接---目的基因与载体相连 转---转入宿主细胞 筛---筛选阳性重组体
接---目的基因与载体相连
目的基因的连接转化refresh.
（上述1－3步骤已经由实验室完成）
水浴摇床
4） 取1ml 菌液冰浴5min，
然后6000rpm，离心5 min ，收集菌体。 5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100ul 冰冷的 100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。
6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加 入100ul冰冷100 mmol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。 7）4oC可保存1-2周；长期保存， 可加甘油至终浓 度为15%，置-70oC备用。
2） 如何在胶上估计DNA的含量： DNA marker 参比法。（50ng/5ul） 电泳样本：Marker 5ul、T载体 1ul、回收片段。 电泳后通过判断电泳样品的亮度，大致判断连接 片段和载体的比例。
9:20~~9:45
二、PCR产物与T载体的连接
T载体一般是从公司购买的，因此，载体DNA的含量和浓 度是已知的。连接反应成败的关键是估计目的 DNA 的量。可 按下列配方进行连接反应： 回收的DNA片段 T载体 T4 DNA 连接酶buffer T4 DNA ligase 7 1 1 1 l l l l
平端连接通常需要先将载体的5端磷酸去掉， 然后再进行连接，这样可以防止载体的自身环化。 当载体的5端磷酸去掉后，片段与载体的连接 就会留下一个缺口，连接酶由于载体5端缺乏磷酸 而无法形成磷酸二酯键， 转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基 团加上，再形成磷酸二酯键。
三、感受态细胞的制备
9:45~10：45
目的 DNA 重组质粒
转化
无质粒的E.Coli 死亡
有质粒的E.Coli 存活
平板筛选
8:10~~9:20
一、 PCR产物的电泳及回收
目的基因的连接、转化、涂板培养ppt
插入片段 （LacZ基因失活）
Thank you!
实验器材
器材： 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无 菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分 光光度计,微量移液枪。
试剂
1.LB琼脂固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无
转---转入宿主细胞
感受态细胞 感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化
学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成 为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
实验原理 ---CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细 菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时 处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌 膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA 酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作 用促进细胞对DNA的吸收。
反应体系
pMDTM18-T Vector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）
①
②
pMDTM18-T Vector
0.5μl
0.5 μl
PCR扩增产物
4.5μl
Control Insert DNA
1μl
ddH2O Solution I
3.5μl
5μl
5μl
总体积
10μl
10μl
16℃反应30-60 分
6.感受态细胞分装成100μl的小份,暂且不用的贮存于70℃可保存半年。 取其中一份进行转化。
细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时
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三、感受态细胞的制备
9:45~10：45
（无菌操作）
LB培养基琼脂平板的制备
蛋白胨： 酵母提取物： NaCl： 琼脂： 蒸馏水： 终体积： 10 g 5g 10 g 15 g 800 ml 1L
10:45~~11:00
高压灭菌20分钟。
学生操作：冷却至50oC ，加入抗生素。 铺琼脂平板
下午实验内容：
1、连接产物的转化 2、平板筛选
4、连接产物的转化
2 、挤胶法
（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的 琼脂糖凝胶切下，放入小离心管中； （2）将切下来的胶块，-70oC冷冻15min；
（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取 挤压后得到的液体。
3、回收试剂盒（商业化）。
回收后鉴定
1） 当回收的片段是用于与载体的连接，准确判断回 收片段的DNA含量是非常重要的。将回收得到的片段 进行电泳分析，通过与 DNA Marker 条带的比较，可 以粗略判断回收片段的量，为连接反应估计加入多少 目的基因片段提供参考，可增加连接效率。
（上述1－3步骤已经由实验室完成）
水浴摇床
4） 取1ml 菌液冰浴5min，
然后6000rpm，离心5 min ，收集菌体。 5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100ul 冰冷的 100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。
6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加 入100ul冰冷100 mmol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。 7）4oC可保存1-2周；长期保存， 可加甘油至终浓 度为15%，置-70oC备用。
终体积
10 l
轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。 连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。 （低温连接效果比室温好）
TA克隆原理
1、TagDNA 聚合酶的一个功能： 使PCR产物的3`端突出一个A。
5` 3` A
A
3`
5`
2、商业设计的T载体：在3`端多出一个T。
2）无菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。 各种器具均需消毒。
无菌超净工作台
感受态细胞的制备
1） 将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线， 置37oC12-16小时。 2） 次日从琼脂平板上取一单菌落， 于2ml LB培养基中， 37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。 3） 取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中， 37oC， 225rpm的速度震荡培养直至 OD值为0.5左 右(约3小时)。
5）将残存菌液轻轻混匀， 铺于含有氨基苄青霉素的 LB琼脂培养板上涂匀，室温放置5-10min，的平皿面朝下放置： 防止水蒸气形成的水滴影响 细菌单菌落的形成。
转化菌的蓝白筛选
基本原理：
载体中 LacZ 基因可编码 b- 半乳糖苷酶，后者 可分解培养物中的X-gal，使其呈蓝色反应 。 如果外源基因插入位于 LacZ 基因内部的多克 隆酶切位点中，该载体不能编码 b- 半乳糖苷酶， 菌落呈正常的白色。 能否采用蓝白筛选，关键是载体。
目的 DNA 重组质粒
转化
无质粒的E.Coli 死亡
有质粒的E.Coli 存活
平板筛选
8:10~~9:20
一、 PCR产物的电泳及回收
1）PCR产物电泳： 15ul产物+3ul上样液 1%琼脂糖凝胶，100伏，30分钟。
2） PCR产物的回收（挤胶法）
（ 1 ）在 UV 灯下，用手术刀片 将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶切 下，放入封口膜中； 预期PCR电泳结果
感受态细胞制备原理
培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗 CaCl2 存在的情况下，细菌变得膨胀而易 于外源基因的导入。 另外，钙离子溶液处理的细胞对外源 DNA的摄取能力增强。
说明：
1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。
如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞 膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通 细胞状态，失去接受外源DNA的能力。
实验三、 PCR 产物的电泳、回收 目的基因的连接、转化
实验内容
1. PCR产物的电泳、回收； 2. PCR产物与T载体的连接 3. 感受态细胞的制备 ； 4. 连接产物的转化； 5. 铺制LB培养平版； 6. 涂菌培养过夜 。
实验回顾
RNA提取
RT-PCR
目的 DNA片段
质粒 TA载体
PCR
连接
2） 如何在胶上估计DNA的含量： DNA marker 参比法。（50ng/5ul） 电泳样本：Marker 5ul、T载体 1ul、回收片段。 电泳后通过判断电泳样品的亮度，大致判断连接 片段和载体的比例。
9:20~~9:45
二、PCR产物与T载体的连接
T载体一般是从公司购买的，因此，载体DNA的含量和浓 度是已知的。连接反应成败的关键是估计目的 DNA 的量。可 按下列配方进行连接反应： 回收的DNA片段 T载体 T4 DNA 连接酶buffer T4 DNA ligase 7 1 1 1 l l l l
5`
3` T
T 3`
5`
3、两者的粘性末端可以互补配对。
应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接 后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。
其他说明：
1） 连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例， 一般片段与载体比例为2:1 或3:1（摩尔比），根据 片段大小决定比例。
2）平端连接
（2）将切下来的胶块，标记好 姓名，-20℃冰箱中 。 （3）放在封口膜内直接挤压， 用加样器吸取挤压后得到的液 体。
结合片子讲切胶的问题 (不要切引物）
常见回收方法介绍
1、 冻融法：
1） 在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂 糖凝胶切下,-70oC冷冻至少15min。 2） 在65oC水浴中使胶融化，加入等倍体积TE-饱合 酚,剧烈振荡30秒钟，然后-70oC冷冻15min。 3） 室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水 相移 至另一管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积 3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀、漂洗和干燥DNA。
蓝 白 克 隆 筛 选
如何制备用于蓝白筛选的培养基：
一般有两种方法：一种是将IPTG、X-gal 加入到培养基中，另一种是在培养基表面涂 沫。后者比较节省，但前者效果最好。
13:00~~14:30
1）将200l感受态细胞置冰上融化， 然后加入3l DMSO, 混合后， 加入10l连接反应液(含重组质粒), 温和混匀， 置冰上10分钟。
(目的：防止细胞被胀破。)
2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟。
10l 连接反应液一般可以进行2-3次转化
3）加入1 ml LB培养液， 37oC，225rpm摇荡培养30分钟。 4） 6,000rpm，离心10秒钟，倒掉上清，用剩余的约 200l LB培养液重悬菌体。