动物组织中总RNA的提取教学文稿
动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲
实验案例三：实时荧光定量PCR检测大熊猫肠道微生物群落结构 变化
实验目的：研究大熊猫肠道微生物群落结构变化，了解其与消化、营养等方面的关系。
实验原理：实时荧光定量PCR技术通过荧光染料或探针标记特异性引物，实现对目标基因的定 量检测。
存
细胞分离：将 组织粉末离心， 使细胞沉淀，
去除上清液
细胞裂解：用 细胞裂解液处 理细胞沉淀， 使细胞裂解成
单个细胞
RNA提取：将 裂解液与RNA 提取试剂混合， 离心后去除上
清液，得到 RNA沉淀
提取注意事项
防止RNA酶的污染：实验操作中应避免RNA酶的污染，如戴手套、使用无RNA酶的塑 料制品等。
数据分析软件：可使用专业的生物 信息学软件进行实验数据解读和多 基因表达分析。
动物组织RNA提取及荧光定量 PCR实验案例分享与解析
实验案例一：实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒基因表达水平
实验目的：检测 猪瘟病毒基因表 达水平，了解病 毒在感染过程中
的变化。
实验原理：实时 荧光定量PCR技 术通过荧光染料 或探针，实时监 测PCR产物量的 变化，从而实现 对起始模板的定
动物组织RNA提取及荧光定量 PCR实验方案设计
实验目的与要求
掌握动物组织RNA提取及荧光定量PCR实验原理 学会实验方案的设计与实施 了解荧光定量PCR的定量准确性及重复性要求 熟悉实验过程中的注意事项与操作规范
实验材料选择与准备
动物组织样本： 新鲜、无菌、无 污染
试剂：RNAiso Plus、DEPC水、 氯仿、异丙醇、 75%乙醇、无水乙 醇
总RNA的提取和检测 实验报告
总RNA的提取和检测实验报告实验二总RNA的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法；2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法；3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱；实验原理概述1. 10-5 μg RNA/细胞含有rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5%2. mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4.目前常用的是Trizol法。
Trizol的主要成分是一种新型总RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。
2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA 酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。
(三)总RNA的纯度检测原理：不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。
RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。
因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL 的单链RNA。
用PH= 的TE稀释RNA样品n倍并以TE为空白对照，根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000实验步骤样品处理与Trizol用量1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；2.悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106个细胞加1mL Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
适宜于实验教学的动物组织总RNA提取的操作方法
适 宜 于 实 验 教 学 的 动 物 组 织 总 ＲＮ Ａ 提 取 的 操 作 方 法
李 银 聚 ， 春 杰 张
（ 河南 科技 大 学 动 物 科 技 学 院 ， 南 洛 阳 ４ １０ ） 河 ７ ０ ３
摘 要 ：为 探 索 适 宜 于 实验 教 学 的 动 物 组 织 总 ＲＮ 的 提 取 方 法 ， 用 氯 仿 处 理 实验 器皿 、 材 和 水 Ａ 采 耗
烤玻 璃器 皿和金 属 用具 ， 管 和 移液 器 吸 头等 耗 材 试
用 ＤＥ Ｃ 水 处 理 。实 验 教 学 过程 中 ， Ｐ 由于 人 员 多 ，
中分 离 纯 化 Ｒ ＮＡ。 Ｒ ＮＡ 质 量 的 高 低 常 常 影 响 Ｒ Ｔ～ Ｃ ｃ ＮＡ库构 建和 Ｎｏｔ ｅｎ ｌｔ 分子 Ｐ Ｒ、Ｄ ｒｈ ｒ —Ｂｏ 等
生物 学 实 验 的 成 败 。 由 于 受 到 内 源 性 和 外 源 性 Ｒ ＮＡ酶 的降解作 用 ， 加上 实验准 备和操作 过程 难 再 免 出现 纰漏 ， 以获 得 高 质量 的 Ｒ 难 ＮＡ。Ｒ ＮＡ 的提 取 方法很 多［ ］ 由 于组 织 的结 构 和组 成 不 同 ， 种 １ ， 。 一 方法很难 适 用 于所 有 组 织 Ｒ ＮＡ 的 提 取Ｌ ］ ５ 。动 物 。 鲜 活组织 中 Ｒ ＮＡ 酶的含 量 和活 性都 很 高 ， ＮＡ 提 Ｒ 取 液 中含 有 的 Ｒ ＮＡ 酶变 性 剂 ， 以很 大 程 度 地 降 可 低 细胞破 碎 过 程 中 内 源性 Ｒ ＮＡ 酶 的 活性 。因 此 ，
以降低 外 源性 ＲＮ 酶 对 ＲＮＡ 的降解作 用 。结果表 明 ， 作过程 中合理 利 用氯仿 能够有 效降低 外 Ａ 操
源 性 ＲＮＡ 酶 的 污 染 ； Ｄ Ｐ 水 处理 效 果 相 比 ， 取 的 总 ＲＮ 均 可 用 于 分 子 生 物 学研 究和 ＲＴ— 与 Ｅ Ｃ 提 Ａ
组织总RNA的提取
实验五植物组织总RNA的提取一、实验目的：RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
通过本实验掌握利用Trizol法提取植物总RNA的方法和步骤。
二、实验原理：TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
二．样品提取：1、将组织在液氮中磨成粉末，加入TRIzon溶液，每50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、样品中加入TRIzon后反复吸打，使样品充分裂解，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3、每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，放置2-3分钟。
4、4℃，12000rmp离心15分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相。
取上层水相于一新的离心管。
5、在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，12000rmp离心10分钟。
6、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇对沉淀进行洗涤。
7、4℃，12000rmp，离心3分钟，小心弃去上清液，勿弃RNA沉淀。
8、室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，得到的RNA保存在－80℃，防止降解。
三、注意事项：1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
3、在收集到生物材料之后，最好能即可进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将材料急速冷冻后，储存于-80℃冰箱。
在制备RNA时，将储存于冰箱的材料取出，立即加入液氮研磨，绝不可以先行解冻。
总rna提取实验报告
总rna提取实验报告总RNA提取实验报告一、引言RNA是一种重要的核酸分子，它在细胞中起着传递和转录遗传信息的重要作用。
总RNA提取是分子生物学研究中常用的实验技术，它能够从细胞中提取出所有的RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA等。
本实验旨在通过总RNA提取技术，获取细胞中的RNA样品，为后续的RNA分析提供基础。
二、材料与方法1. 实验材料：- 细胞样品：本实验使用细胞系A作为研究对象。
- 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解酶和蛋白酶抑制剂等。
- 乙酰酸酚/氯仿溶液：用于提取总RNA。
- 无水乙醇：用于沉淀RNA。
- TE缓冲液：用于溶解RNA沉淀物。
- RNase-free水：用于制备实验液。
2. 实验步骤：（1）细胞采集与裂解：将培养好的细胞收集到离心管中，加入适量的细胞裂解缓冲液，轻轻摇晃使细胞均匀裂解。
（2）总RNA提取：将细胞裂解液与乙酸酚/氯仿溶液按比例混合，离心分离上清液和有机相，收集上清液。
（3）沉淀RNA：向上清液中加入等体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀，沉淀RNA。
（4）洗涤：用70%乙醇洗涤RNA沉淀物，去除杂质。
（5）溶解：用RNase-free水溶解RNA沉淀物，得到总RNA样品。
三、结果与讨论通过上述实验步骤，成功地从细胞系A中提取到了总RNA样品。
提取后的总RNA样品呈现出明亮的透明溶液，没有明显的沉淀或杂质。
为了验证提取的总RNA质量和纯度，我们使用了紫外吸收光谱法进行测定。
根据测定结果，我们发现总RNA样品的吸光度比例A260/A280为1.8，符合理想的RNA纯度范围（1.8-2.0）。
这表明我们所提取的总RNA样品中没有明显的蛋白质、核酸污染。
同时，我们还进行了琼脂糖凝胶电泳分析，观察到总RNA 样品在琼脂糖凝胶上呈现出清晰的17S和28S两个带状条带，证明我们提取的总RNA完整且无降解。
总RNA提取实验是RNA研究的基础，成功地提取到高质量的总RNA样品对后续的实验具有重要意义。
动物组织中总RNA的提取教程文件
(二).鉴定（1.5%琼脂糖电泳鉴定）
操作
1、制胶：1.5%琼脂糖加热溶解冷到
60℃加EB后倒入制胶板中，待凝胶固化
2、加样：15ulRNA提取液+3ul loading buffer
3、电泳80-120v,30分钟
4、紫外灯下观察结果
三.注意事项
防止RNA酶的污染
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干 烤6hr或更长时间。
3.原理
破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗 涤RNA→溶解RNA→鉴定RNA → 保存 RNA
1、 破碎组织:可以用盐酸胍、异硫氰酸 胍、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入 β-ME可以抑制RNA酶活性
2、 分离RNA:一般用酚、氯仿等有机 溶剂，加入少量异戊醇，经过此步， 离心，RNA一般分布于上层，与蛋白 层分开
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。 3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水 冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然 后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理 12hr以上。 5、 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中 手套要勤换,避免在操作中聊天。
关于样本保存
用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。
RNA保护剂，如RNAlater是具有抑制 RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织 样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定 样本中RNA的作用。
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动物组织中总RNA的提取
通过寡聚脱氧胸苷（OligodT）制备 mRNA
从动物组织中提取总RNA的CTAB法_左欣欣
开 发 应 用从动物组织中提取总RNA的CTAB法左欣欣 陈泽宇 马 腾 严海燕 谭艳平（中南民族大学生命科学院，湖北 武汉 ４３００７３） 摘 要：在生物及生物技术的研究和应用中，ＲＮＡ的提取已经成为重要的基本实验技术。
本研究对ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ的过程 中影响因素进行分析，尝试采用改良的ＣＴＡＢ方法从动物组织中提取总ＲＮＡ。
通过紫外分光光度法和凝胶电泳检测分析可 知，采用该方法提取的总ＲＮＡ纯度高，完整性好，电泳条带完整清晰，可以进行下一步的分子生物学研究。
结果表明， 用改良的ＣＴＡＢ法提取动物组织ＲＮＡ是切实可行的，它具有简便、实用性强的特点，是一个符合分子生物学实验教学要求 的新方法。
关键词：ＲＮＡ提取；动物组织；ＣＴＡＢ法；实验教学；分子生物学技术 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－６３９６．２０１１．０２．０１８ Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｚｕｏ ｘｉｎ－ｘｉｎ，ＣＨＥＮ Ｚｅ－ｙｕ，ＭＡ Ｔｅｎｇ，ＹＡＮ Ｈａｉ－ｙａｎ，ＴＡＮ Ｙａｎ－ｐｉｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｏｕｔｈ－ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ ４３００７３） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， ａｆｔｅｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， Ｗｅ ｕｓｅ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｔｙ， ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｎｏｎ－ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃ． Ｉｔ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈａｔ ｍｅｅｔｓ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｌａｂ ｔｅａｃｈｉｎｇ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ； Ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； Ｌａｂ ｔｅａｃｈｉｎｇ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＲＮＡ提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部 分，也是功能基因组学技术的重要基础 。
磁珠法动物组织总rna提取试剂
磁珠法动物组织总rna提取试剂动物组织总RNA提取是一项重要的实验步骤，其中磁珠法被广泛应用。
本文将介绍磁珠法动物组织总RNA提取试剂的原理、操作步骤和优势，以及其在科研工作中的应用。
一、磁珠法动物组织总RNA提取试剂的原理磁珠法动物组织总RNA提取试剂是一种基于磁性珠子的提取方法。
其原理是利用磁性珠子表面的羧基与RNA中的氨基结合，形成稳定的结合，从而实现RNA的高效提取。
该试剂具有高选择性和高纯度的特点，可有效去除DNA、蛋白质和其他杂质。
二、磁珠法动物组织总RNA提取试剂的操作步骤1. 准备工作：将动物组织样品切割成小块，并加入适量的细胞裂解缓冲液。
2. 组织裂解：利用机械或化学方法将组织完全裂解，使细胞内的RNA充分释放。
3. 加入磁性珠子：将磁性珠子加入细胞裂解液中，并充分混匀，使珠子均匀分散。
4. 结合RNA：在一定的温度和时间下，RNA与磁性珠子表面的羧基发生结合，形成RNA-磁性珠子复合物。
5. 分离复合物：利用磁性装置将RNA-磁性珠子复合物迅速沉降，然后去除上清液，以实现复合物的分离。
6. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤复合物，去除杂质和残余试剂。
7. 释放RNA：将洗涤后的复合物加入洗脱缓冲液，使RNA从磁性珠子上释放出来。
8. 收集RNA：将释放的RNA收集下来，即可用于后续的实验操作。
三、磁珠法动物组织总RNA提取试剂的优势1. 高效性：磁珠法能够在较短的时间内提取高纯度的RNA，适用于大规模样品的处理。
2. 纯度高：该方法能够有效去除DNA、蛋白质和其他杂质，获得高纯度的RNA。
3. 灵敏度高：磁珠法能够提取低浓度的RNA，适用于少量样品和低表达基因的研究。
4. 操作简便：该方法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适用于实验室内各种规模的科研工作。
5. 可靠性强：磁珠法提取的RNA具有较好的稳定性和可靠性，适合多种分子生物学实验的需求。
四、磁珠法动物组织总RNA提取试剂在科研工作中的应用磁珠法动物组织总RNA提取试剂在生物医学研究中广泛应用。
总rna提取实验实施方案
总rna提取实验实施方案总RNA提取实验实施方案。
一、实验目的。
总RNA提取是分子生物学研究中的重要步骤，其目的是从样本中提取出完整的总RNA，以便后续进行RNA定量、转录组分析等实验。
本实施方案旨在介绍一种简便、高效的总RNA提取方法，以满足科研工作者的实验需求。
二、实验材料。
1. 细胞或组织样本。
2. TRIzol试剂。
3. 氯仿。
4. 异丙醇。
5. 75% 乙醇。
6. DEPC水。
7. RNase-free 离心管。
8. 离心管架。
9. 离心机。
10. 磁力搅拌器。
11. 离心管枪。
12. 紫外可见分光光度计。
13. 微量吸光度计。
三、实验步骤。
1. 样本的收集和处理。
a. 采集细胞或组织样本，迅速转移到含有适量TRIzol试剂的离心管中。
b. 使用离心管架和离心机将样本在室温下离心10分钟，以沉淀细胞或组织。
2. 细胞或组织的裂解。
a. 将裂解后的样本加入氯仿，摇匀离心管，置于室温静置5分钟。
b. 离心管在室温下以12000×g离心15分钟，将上清液转移到新的离心管中。
3. RNA的沉淀和洗涤。
a. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，放置室温10分钟。
b. 离心管在室温下以12000×g离心10分钟，将上清液倒掉。
c. 加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，离心管在室温下以7500×g离心5分钟，将上清液倒掉。
d. 使用DEPC水溶解RNA，测定浓度和纯度。
四、实验注意事项。
1. 操作过程中需严格避免RNase的污染，使用RNase-free试剂和消耗品。
2. 操作过程中需注意样本的保存和处理，避免RNA降解。
3. 实验过程中需严格按照试剂说明书和操作规程进行操作，确保实验可重复性和结果的准确性。
五、实验结果分析。
通过上述实验方案提取的总RNA样品，可以进行后续的RNA定量、cDNA合成、转录组分析等实验。
同时，可以通过紫外可见分光光度计和微量吸光度计对RNA样品的浓度和纯度进行检测，以保证后续实验的顺利进行。
从动物组织中提取总RNA的CTAB法
Ｚｕ ｉ ． ｉ ＣＨＥＮ — ｕ Ｍ Ａ ｅ ｇ Ｙ ｏ ｘ ｎ ｘ ｎ， Ｚｅ ｙ ， Ｔ ｎ ， ＡＮ ｉｙ ｎ Ｔ Ｈａ ． ａ ， ＡＮ ａ — ｎ Ｙ ｎ ｐｉ ｇ
（ ｌ ｇ ｆ ｉ ｃｅ ｃ ｓ Ｓ ｕ ｈ ｃ ｎ ｒ ｌ ｉｅ ｓ ｙｆ ｒ ｔ ｎ ｌ ｉｓ ｗｕ ａ ， ｂ ｉ ３ ０ ３ Ｃｏｌ ｅｏ ｆ Ｓ ｉｎ ｅ ， ｏ ｔ ．ｅ ｔａ Ｕｎｖ ｒ ｉ ｉ ａｉ ｅ ， ｈ ｎ Ｈｕ ｅ ０ ７ ） ｅ Ｌ ｅ ｔ ｏ Ｎａ ｏ ｔ ４
ｒ 壅 堕 ＿ ］
从动物组织中提取总Ｒ Ａ Ｎ 的Ｃ Ａ 法 ＴＢ
左 欣 欣 陈 泽 宇 马 腾 严 海 燕 谭 艳 平
（ 中南民族 大学生命科 学院 ，湖 北 武汉 ４ ０ ７ ） ５ ０ ３
摘 要 ：在 生 物 及 生 物 技 术 的研 究 和 应 用 中 ，Ｒ Ａ Ｎ 的提 取 已经 成 为 重 要 的 基 本 实 验 技 术 。 本 研 究 对Ｃ Ａ ＇提 取 Ｒ Ａ ＴＢ － ￣ ， Ｎ 的过 程
ｂｏ ｅ ｈ ｌ ｇ ｅ ｅ ｒｈ ａ ｄ ａ ｌ ａ ｉｎ． ｎ ｔ ｉ ｐ ｐ ｒ ａ ｔｒｓｕ ｙｎ ａｉ ｕ ａ ｔ ｒ ｆｅ ｔｎ ｉｔｃ ｎｏｏ ｙｒ ｓ ａ ｃ ｎ ｐｐｉ ｔｏ Ｉ ｈｓ ａ ｅ ． ｆｅ ｔ ｄ ｉ ｇｖ ｒｏ ｓｆ ｃｏ ｓａ ｆｃｉ ｇＲＮＡ ｘ ｒ ｃｉｎ ｑ ａｉ ｔ ｃ ｅ ｔａ ｔ ｕ ｌｙｗｉ ｏ ｔ ｈ
Ｒ Ａ 提 取 。 Ｃ Ａ 法 所 用 的 试 剂 均 为 常 规 试 剂 ， 并 日与 Ｎ的 ＴＢ ．
末 ，将 粉 末 状 样 品 转 移 至 预 热 好 的 装 有 Ｃ Ａ 提 取 缓 冲 液 离 心 ＴＢ 管 中 ， 混 合 均 匀 。在 ６ ￣水 浴 加 热 ５ ｉ ，其 问每 隔２ ｉ轻 轻 ５Ｃ ｍｎ ｍｎ
动物组织细胞总RNA的抽提及检测(TRIzol法)
动物组织/细胞总RNA的抽提及检测（TRIzol法）背景知识：细胞质总RNA中，有rRNA、tRNA、mRNA等。
绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、干扰素和有些组蛋白mRNA外）的3’端存在20~250个多聚腺苷酸PolyA。
利用此特性，可很方便得从总RNA中，用寡聚（dT）亲和层析柱分离出mRNA。
RNA分离的关键因素是尽量减少RNA酶的污染。
RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNase以外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液以及唾液中均存在RNase。
这类酶耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性可使之暂时失活，但在变性剂去除后，又可恢复活性。
所以在实验的操作过程中，应尽量减少RNAse污染的机会。
在整个操作过程中，在一个洁净的环境中，戴手套和口罩，所用的器皿、水和试剂需用焦炭酸二乙酯（DEPC 很强的RNAse抑制剂）处理过。
玻璃器皿的处理。
在常规洗净后，应用0.1% DEPC浸泡2h以上，再用双蒸水漂洗几次，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4h以上。
塑料器材应用一次性的、新的，在使用前高压消毒，严格一些可以用0.1%DEPC浸泡过夜，高压灭菌。
所用试剂应加DEPC至0.05%~0.1%，室温过夜，然后高压处理。
但是，Tris与DEPC反应，所以在配制Tris时，应用DEPC处理过的水配制，最好再高压消毒。
方法一：1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于研钵中，用剪刀剪碎组织，研钵中加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨成粉末状，每100mg组织加入1ml TRIzol，在水浴中迅速匀浆15~30秒，以充分研碎组织。
然后，将细胞悬浮液吸入另一1.5ml微量离心管中，室温下静置5min。
2.若为贴壁细胞，培养预定时间后，弃掉沉淀培养液。
将TRIzol试剂直接加到贴壁细胞上，室温放置10min；若为悬浮细胞，则直接离心收集细胞后用TRIzol重悬、裂解，每1ml TRIzol可裂解5*106个动物、植物或酵母细胞，或1*107个细菌菌体。
动物组织总RNA提取实验操作
常规动物组织总RNA提取
(Trizol法)
实验操作流程
1摘要
本标准操作规程适用于一般动物组织的总RNA提取，一般情况下能得到高质量的总RNA。
2提取步骤
a)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成
粉末。
b)把样品粉末转入到装有TRIzol裂解液的2.0mL EP管中，（每mL裂解液可加50mg组
织样品）剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min。
c)10000rpm，4℃离心5min。
d)吸取上清液至新的2.0mL EP管中，每毫升裂解液加入200μL氯仿/异戊醇，剧烈颠倒
混匀。
e)10000rpm，4℃离心10min。
f)吸取上清液至新的1.5mL离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异
丙醇，轻轻颠倒混匀。
g)放入-20℃冰箱沉淀1h。
h)13600rpm，4℃离心20min。
i) 吸弃上清，加入1mL 75%乙醇，用移液器吹洗沉淀。
j) 10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min。
k)用30-100μL DEPC水或者RNase-free水溶解沉淀。
3设备与试剂
3.1设备
3.2试剂。
动物组织细胞总RNA的提取实验原理及步骤
实验十一动物组织细胞总RNA的提取一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。
对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。
获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。
由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。
再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。
在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase 活性，保护RNA分子不被降解。
因此提取必须在无RNase的环境中进行。
可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。
提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。
并有助于除去非核酸成分。
本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行鉴定。
二、仪器和试剂1.仪器：超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。
2.试剂：(1)细胞裂解液：异硫氰酸胍 4mol/L柠檬酸钠（pH7.0） 25mmol/L十二烷基肌氨酸钠 0.5%β-巯基乙醇 0.1mol/L称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。
然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。
(2)10×凝胶缓冲液：吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/LNaAc 100mmol/LEDTA(pH 8.0) 10mmol/L过滤除菌后避光保存。
实验培训项目一：RNA的提取
RNA提取方法（以兔子肝脏为例）
准备试剂：T RNzol-A+总RNA提取试剂、氯仿、异丙醇、RNase-Free ddH2O 、75%乙醇(用RNase-Free ddH2O配制)。
1.样品处理
将灭菌处理的研砵用液氮预冷，从液氮罐中取冻存的兔子肝脏组织，保持低温状态将组织研磨成粉末，取适量收集至预先装有1 mL Trizol的1.5mL EP离心管中（按50-100mg组织加1mLTrizol）,颠倒混匀，以使组织裂解充分，室温静置5min;
2. 分离阶段
按每1mlTrizol中加0.2mL氯仿。
盖好管盖，用力摇晃15s，使其充分混匀，室温静置3min。
之后4℃，12000rmp离心10min（样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中）;
3. RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mLEP离心管中（约400-500μl），加入等体积的异丙醇，震荡混匀，-20℃静置30min，后12000rmp离心10min;
4. RNA的洗脱
弃上清，留取沉淀。
加入1 mL冰预冷的75%乙醇振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心3min;
5. RNA的再溶解
弃上清，用枪头小心吸取残留的液体，室温自然干燥（干燥时间不宜过久），加入50-100 μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA;
6. RNA的检测保存
测定浓度，取1 μL RNA加入1 μL 4 x RNA loading buffer，混匀加入甲醛变性胶电泳或琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
RNA样品保存于-70℃超低温冰箱;。
实验12 总RNA提取
5．加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室 温静置5分钟。 6．4℃ 12 000×g离心5分钟，弃上清。 7．加入1mL 75℅乙醇，轻轻洗涤RNA 沉淀，4℃ 12 000×g离心5分钟，弃上清。 8．室温晾干或真空干燥，约干燥5分钟 即可。 9．加入100μL无RNase水溶解RNA ,然 后总RNA用于RT-PCR实验。实验12源自TRIzol试剂法提取总RNA
一 实验原理 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后 经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，样品分 成水样层和有机层，RNA存在于水样层 中。收集水样层后，通过异丙醇沉淀 RNA，再经过洗涤、晾干、最后溶解等 步骤即得到相对较纯的RNA。
实验步骤 1．防止RNase污染的准备 2．提取样品的处理 将小鼠处死，取半只肝脏，用生理盐水洗 去血迹， 加入5mLTRIzol，用匀浆器进行匀 浆处理。 3．每组取1mL匀浆液加入0.2mL氯仿， 剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 4．4℃ 12 000×g离心10分钟，RNA主要 在上层水相中， 转移水相至新的无RNase离 心管中。
果蝇总RNA提取
果蝇总RNA提取果蝇总RNA和总蛋白的提取与电泳条带分析摘要：本实验第一部分用果蝇成体为材料，以Trizol为提取液提取total RNA，进行反转录制备cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测total RNA和cDNA浓度，并结合电泳图谱对total RNA和cDNA图样进行分析；第二部分以果蝇幼体为材料，提取总蛋白，通过SDS-PAGE 检测果蝇总蛋白表达，对表达结果进行简要分析，并比较了成体和幼体果蝇的蛋白表达差异。
关键词：果蝇；total RNA；总蛋白；反转录；RT-PCR1 前言果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名：Drosophila melanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。
果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。
1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代[1]，之后的二十年中，一系列的科学发现补充了中心法则的各个环节，由此进入现代分子生物学发展阶段，基因工程技术也应运而生。
基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。
本实验的方法及步骤若应用到基因工程中则可划分到目的基因的获取这一环节。
即根据中心法则，DNA 上的遗传信息经转录传递到mRNA，而mRNA含量较少，可通过提取总RNA 的方法获得mRNA，再经特定引物的反转录获得cDNA，进而得到目的基因从而应用到分子及发育生物学研究中去。
动物组织及细菌全RNA提取及qPCR
动物组织及细菌全RNA提取及qPCR动物组织RNA提取及qPCR在生物及生物技术的研究和应用中，RNA的提取已经成为重要的基本实验技术。
对某一生物或组织进行表达研究时，RNA提取是实验进行的第一步，只有获得具有生物活性及化学稳定的完整RNA分子才能保证后续研究工作。
TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
主要成分是苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
实验操作：二、动物组织RNA1.组织全rna提取a)提前准备好清洗干净且放干的碾钵，用锡箔纸包好。
180℃干热3h后，自然降温到室温备用。
b)将无菌无酶的ep管从超净台中取出，并做好相应的标记。
c)将保存于-80℃的组织样取出，放到液氮中。
并取适量的组织低温研磨，取50-100mg组织粉末装入ep管中。
（组织粉末体积不超过trizol体积的10%）d)在超净台中分别加入1mL trizol液体，充分混匀，室温放置5min。
e)加入200uL氯仿，盖紧盖子，剧烈震荡15s。
f)12000rpm离心10min。
g)另取一批新离心管，加入500ul异丙醇。
将离心完毕的上层水相转移到相应的ep管后，温和颠倒混匀。
h)室温放置10min（或者过夜-20℃沉降），4℃，12000rpm，10min。
i)小心的弃去上清，保留底部沉淀。
加入1mL提前遇冷的用depc 水处理过的容器配置的75%乙醇-depc水溶液。
动物组织细胞总RNA的制备及检测
动物组织/细胞总RNA的制备及检测实验目的：使学生掌握采用Trizol抽提法从动物新鲜组织或细胞制备总RNA的实验技术，以及用紫外分光光度法检测RNA的纯度及定量、用琼脂糖电泳法检测RNA的完整性及质量。
实验原理：Trizol是一种新型的总RNA即用型制备试剂，适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。
Trizol 试剂是由苯酚和异硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。
在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
但酚虽可有效的变性蛋白质，却不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
0.1%的8-羟基喹啉与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。
Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。
Trizol可以抽提长达15 kb的RNA，也可以抽提microRNA等小RNA。
抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。
一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、分离mRNA、RNase保护分析、体外翻译、cDNA克隆、基因表达芯片分析、高通量测序等。
紫外吸收法测定核酸含量的原理：DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。
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(%琼脂糖加热溶解冷到
60℃加EB后倒入制胶板中，待凝胶固化
2、加样：15ulRNA提取液+3ul loading buffer
3、电泳80-120v,30分钟
4、紫外灯下观察结果
三.注意事项
防止RNA酶的污染
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干 烤6hr或更长时间。
二.操作步骤:
(一).总RNA的提取
1.匀浆(准备室准备):裂解组织细胞, 使RNA酶失活, 使核酸从核蛋白中 解离出来(RNP=PNA+Pr.)
2.取1ml匀浆液至消毒的1.5ml的 eppendorf管中,加入0.2ml氯仿,剧烈震 荡15sec,室温放置3min,12000rpm离心 10min
3.吸取上层水相转移至干净的eppendorf 管中,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置 20min
4. 12000rpm离心10min,弃上清
5.加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀. 12000rpm离心3min,弃上清,室温干燥510min 6.加入30-50ulRNase-free ddH2O,充 分溶解RNA。将所得RNA溶液置于-70 度保存待用
由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总 RNA流径oligodT纤维素时，在高盐缓冲液 作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中， mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维 素柱，可得到较纯的mRNA在构建cDNA文 库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模 板。
3.原理
破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗 涤RNA→溶解RNA→鉴定RNA → 保存 RNA
1、 破碎组织:可以用盐酸胍、异硫氰酸 胍、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入 β-ME可以抑制RNA酶活性
2、 分离RNA:一般用酚、氯仿等有机 溶剂，加入少量异戊醇，经过此步， 离心，RNA一般分布于上层，与蛋白 层分开
3、 沉淀RNA:一般用乙醇、3M NaAc或异丙醇
4、 洗涤RNA:使用70％乙醇洗涤， 有时，为避免RNA被洗掉，此步可以 省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙 醇，但是不能过于干燥，否则不易溶 解。
5、 溶解RNA一般使用TE。
6. 鉴定RNA:
6. 鉴定RNA:
紫外吸收法: 浓度:OD260=1时,RNA为40ug/ml
关于样本保存
用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。
RNA保护剂，如RNAlater是具有抑制 RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织 样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定 样本中RNA的作用。
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动物组织中总RNA的提取
2.用途:
Northern 杂交:主要用来检测细胞或组织
样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子， 从而判断在转录水平上某基因是否表达，在 有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱 可比较基因表达的强弱。
体外蛋白质的生物）制备 mRNA
常见的RNA酶抑制剂
1.DEPC（二乙基焦碳酸）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑 制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白 质变性，从而抑制酶的活性。 2、 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在 裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸 从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3、 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物， 它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的 活性。 4、 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中 提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑 制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5、 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。 3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水 冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然 后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理 12hr以上。 5、 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中 手套要勤换,避免在操作中聊天。
纯度:OD260/OD280=1.8-2.0 小于1.75:蛋白质污染 大于2.0 :DNA,有机溶剂污染
7、 保存RNA:应该尽量低温
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase 的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需 要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于 长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了， 而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年 仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对 于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了 增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶 解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。
确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：
取RNA样品两份,把其中一份放入70℃的恒温水 浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。 取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电 泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别， 则说 明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很 好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则 说明RNA溶液中有RNA酶污染。