动物组织中总RNA的提取教学文稿

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适宜于实验教学的动物组织总RNA提取的操作方法

中分离纯化ＲＮＡ。ＲＮＡ质量的高低常常影响ＲＴ～ＣｃＮＡ库构建和Ｎｏｔｅｎｌｔ分子ＰＲ、Ｄｒｈｒ —Ｂｏ等
生物学实验的成败。由于受到内源性和外源性ＲＮＡ酶的降解作用，加上实验准备和操作过程难再免出现纰漏，以获得高质量的Ｒ难ＮＡ。ＲＮＡ的提取方法很多［］由于组织的结构和组成不同，种１，。一方法很难适用于所有组织ＲＮＡ的提取Ｌ］５。动物。鲜活组织中ＲＮＡ酶的含量和活性都很高，ＮＡ提Ｒ取液中含有的ＲＮＡ酶变性剂，以很大程度地降可低细胞破碎过程中内源性ＲＮＡ酶的活性。因此，
ｔｓｅｎｄｐｅｏｅｐｒｍｅｔｌｔａｈｎ．ｉｕｓａｄａａｔｄｔｘｅｉｎａｅｃｉｇｓ
Ｋｅｒ：Ａｎｉｌｔｓｕｓｙｗｏｄｓｍａｉｓｅ；ＴｏａｔｌＲＮＡ；ＲＮＡｘｒｃｉｅｔａｔｏｎ；ＲＮＡｎｚｍｅｅｙｓ；Ｃｈｌｒｆｒｏｏｏｍ
ＬＩＹｉ—ｕ，ｎｊＺＨＡＮＧｕ —ｉＣｈｎｊｅ

总RNA的提取(Trizol法提取)

总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提

取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP

管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙

醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g

（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀。

PCR

实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

动物组织总RNA抽提

动物组织总RNA抽提
08应用生物学
RNA提取目的
动物组织 RNA提取 Northern blot
分子克隆体外翻译 RNase保护分析 polyA筛选 ......
注意事项
RNA很脆弱
提取动物组织总RNA对实验要求非常严格
动物组织处理操作台专用药品的特殊处理容器的特殊处理
双蒸水
实验步骤
4. RNA洗涤
Hale Waihona Puke Baidu 弃上清，用小枪头尽量吸净 75℅乙醇洗涤RNA沉淀，吹打。 4℃离心 12000r/min 3min。弃上清，用小枪头尽量吸净。室温放置晾干 2-3min 加入30-50μl ddH2O
加入DEPC 达到0.1％
DEPC 焦碳酸二乙酯与RNA酶活性部位结合,强烈抑制RNA酶活性
实验步骤
1. 匀浆处理：
组织将组织在液氮中磨碎，每50100mg 组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 4℃离心 12000r/min 10min
实验步骤
2 .三氯甲烷萃取
每使用1ml TRIzol加入 0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。4℃离心 12000r/min 10min

动物组织中总RNA的提取教程文件

(二).鉴定（1.5%琼脂糖电泳鉴定）
操作
1、制胶：1.5%琼脂糖加热溶解冷到
60℃加EB后倒入制胶板中，待凝胶固化
2、加样：15ulRNA提取液+3ul loading buffer
3、电泳80-120v,30分钟
4、紫外灯下观察结果
三.注意事项
防止RNA酶的污染
1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
二.操作步骤:
(一).总RNA的提取
1.匀浆(准备室准备):裂解组织细胞, 使RNA酶失活, 使核酸从核蛋白中解离出来(RNP=PNA+Pr.)
2.取1ml匀浆液至消毒的1.5ml的 eppendorf管中,加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15sec,室温放置3min,12000rpm离心 10min
关于样本保存
用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。
RNA保护剂，如RNAlater是具有抑制 RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中RNA的作用。
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3、沉淀RNA:一般用乙醇、3M NaAc或异丙醇
4、洗涤RNA:使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

实验八总RNA提取和反转录教案

（A） 12
28S 18S
（B）
5S,5.8S
(A)细胞总RNA的制备; (B)RT-PCR分析TBX5在不同细胞中的表达
思考题：
• RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？
• 在提取总RNA和反转录的过程中，如何避免RNase的污染？
3. 10000rpm离心5min，RNA主要在上层水相中。转移0.3mL
水相至新的离心管中。
4.加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置5 min。
5. 10000rpm离心5 min，弃上清。
6. 加入1mL 75℅乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，10000rpm离心5min，
弃上清。
ห้องสมุดไป่ตู้
7. 室温晾干(约5～10min)。
8. 加入100μL无RNase水溶解RNA，取50μL用于A260和A280值测定。 9. 计算RNA的浓度和A260/A280值
注意事项:
1.提取总RNA和反转录的整个过程都要严格控制RNase的污染。操作者要配带口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均需要灭活RNase。 2. 反转录中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是温度缓慢下降，否则RNA可能局部复性降低反转录的效率。 3.反转录的反应中对RNA浓度有比较高的要求，因此必需测定 RNA浓度。只有保证RNA浓度在合适的范围内才能提高扩增的成功几率。

从动物组织中提取总RNA的CTAB法_左欣欣

开发应用从动物组织中提取总RNA的CTAB法左欣欣陈泽宇马腾严海燕谭艳平（中南民族大学生命科学院，湖北武汉４３００７３）摘要：在生物及生物技术的研究和应用中，ＲＮＡ的提取已经成为重要的基本实验技术。本研究对ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ的过程中影响因素进行分析，尝试采用改良的ＣＴＡＢ方法从动物组织中提取总ＲＮＡ。通过紫外分光光度法和凝胶电泳检测分析可知，采用该方法提取的总ＲＮＡ纯度高，完整性好，电泳条带完整清晰，可以进行下一步的分子生物学研究。结果表明，用改良的ＣＴＡＢ法提取动物组织ＲＮＡ是切实可行的，它具有简便、实用性强的特点，是一个符合分子生物学实验教学要求的新方法。关键词：ＲＮＡ提取；动物组织；ＣＴＡＢ法；实验教学；分子生物学技术ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－６３９６．２０１１．０２．０１８ＡＭｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢＭｅｔｈｏｄｔｏＥｘｔｒａｃｔＴｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍＡｎｉｍａｌＴｉｓｓｕｅｓＺｕｏｘｉｎ－ｘｉｎ，ＣＨＥＮＺｅ－ｙｕ，ＭＡＴｅｎｇ，ＹＡＮＨａｉ－ｙａｎ，ＴＡＮＹａｎ－ｐｉｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ－ｃｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００７３）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｏｔａｌＲＮＡｈａｓｂｅｃｏｍｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔａｎｄｂａｓｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｆｔｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｖａｒｉｏｕｓｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｗｉｔｈＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ＷｅｕｓｅｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｔｏｔａｌＲＮＡｗｉｔｈｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙａｎｄｙｉｅｌｄｆｒｏｍａｎｉｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ．ＴｈｅｑｕａｌｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈＵＶｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒａｎｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｗｅｒｅｐｕｒｉｔｙ，ｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙａｎｄｎｏｎ－ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｗａｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃ．Ｉｔｉｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｔｈａｔｍｅｅｔｓｔｈｅｎｅｅｄｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｌａｂｔｅａｃｈｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌＲＮＡ；Ａｎｉｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ；ＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ；Ｌａｂｔｅａｃｈｉｎｇ；ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＲＮＡ提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学技术的重要基础。对某一生物或组织进行表达研究时，ＲＮＡ提取是实验进行的第一步，只有获得具有生物活性及化学稳定的完整ＲＮＡ分子才能保证后续研究工作。尽管目前已有多种方法、试剂和商业化产品适用于总ＲＮＡ提取和纯化，一些方法尚有不尽人意之处。如公司提供的用于提取和纯化ＲＮＡ试剂盒，不仅价格较贵，而且ＲＮＡ产物中常伴有大分子量染色体ＤＮＡ污染。特别是以复杂的动物组织为原料时，这个问题显得特别突出。而且在学生人数众多的分子生物学实验教学中，使用试剂盒方法既昂贵又无法讲解原理、分析问题。ＣＴＡＢ法是提取植物ＤＮＡ的经典方法，之后被引用到ＲＮＡ的提取。ＣＴＡＢ法所用的试剂均为常规试剂，并且与ＤＮＡ的提取等其他分子生物学实验的试剂相似，给实验的准备和试剂的购买带来了简便。我们分析提取过程中各种影响因素后，尝试用改进的ＣＴＡＢ法提取动物总ＲＮＡ，获得很好的效果，可以在分子生物学实验教学中大规模使用。本方法是在植物ＲＮＡ提取的教学过程中，由三个实验课程中的本科生在实验课堂之外继续探索的结果。１材料和方法１．１材料收稿日期：２０１０－１１－１９修回日期：２０１０－１２－１７作者简介：左欣欣（１９９０－），女，生物技术专业。通讯作者：严海燕。［３］［２］［１］（１）从市场得到鱼的肝脏，－２０℃ 冰箱冻存备用。（２）仪器：研钵，低温高速离心机，水浴锅，１．５ｍｌ离心管，蛋白核酸测定仪（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｐｌｕｓ），电泳仪。（３）试剂：ＣＴＡＢ提取缓冲液，２ｍｏｌ／ＬｐＨ４．０ＮａＡｃ，水饱和酚，氯仿－异戊醇（２４：１），３ｍｏｌ／ＬｐＨ５．２ＮａＡｃ，异丙醇，１００％乙醇，７５％乙醇，液氮。１．２方法１．２．１ＲＮＡ的提取本研究采用的方法在李靓芳［３］ＣＴＡＢ法的基础上，进行了改良和优化。总ＲＮＡ的提取步骤如下：①在２ｍｌ的离心管加入０．６ｍｌＣＴＡＢ提取缓冲液和１２μＬβ－巯基乙醇于６５℃预热。② 从冰箱里取出５０～１００ｍｇ鱼肝脏，加入液氮迅速地研磨成粉末，将粉末状样品转移至预热好的装有ＣＴＡＢ提取缓冲液离心管中，混合均匀。在６５℃水浴加热５ｍｉｎ，其间每隔２ｍｉｎ轻轻的摇匀。③向混合物中先加入１２０μＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，ＰＨ４．０～４．２，再加入０．６ｍｌ水饱和酚轻轻混匀，再加入１２０μＬ氯仿－异戊醇（２４：１）混匀。将混合物在１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。 ④小心移取上清液到一个新的１．５ｍｌ的离心管中，加入等体积的氯仿－异戊醇（２４：１）混匀，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。⑤ 将所得上清液转移至新的１．５ｍｌ的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，在冰上静止沉淀２０ｍｉｎ，接着取出１２０００ｒ／ｍｉｎ35

磁珠法动物组织总rna提取试剂

动物组织总RNA提取是一项重要的实验步骤，其中磁珠法被广泛应用。本文将介绍磁珠法动物组织总RNA提取试剂的原理、操作步骤和优势，以及其在科研工作中的应用。

一、磁珠法动物组织总RNA提取试剂的原理

磁珠法动物组织总RNA提取试剂是一种基于磁性珠子的提取方法。其原理是利用磁性珠子表面的羧基与RNA中的氨基结合，形成稳定的结合，从而实现RNA的高效提取。该试剂具有高选择性和高纯度的特点，可有效去除DNA、蛋白质和其他杂质。

二、磁珠法动物组织总RNA提取试剂的操作步骤

1. 准备工作：将动物组织样品切割成小块，并加入适量的细胞裂解缓冲液。

2. 组织裂解：利用机械或化学方法将组织完全裂解，使细胞内的RNA充分释放。

3. 加入磁性珠子：将磁性珠子加入细胞裂解液中，并充分混匀，使珠子均匀分散。

4. 结合RNA：在一定的温度和时间下，RNA与磁性珠子表面的羧基发生结合，形成RNA-磁性珠子复合物。

5. 分离复合物：利用磁性装置将RNA-磁性珠子复合物迅速沉降，然后去除上清液，以实现复合物的分离。

6. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤复合物，去除杂质和残余试剂。

7. 释放RNA：将洗涤后的复合物加入洗脱缓冲液，使RNA从磁性珠子上释放出来。

8. 收集RNA：将释放的RNA收集下来，即可用于后续的实验操作。

三、磁珠法动物组织总RNA提取试剂的优势

1. 高效性：磁珠法能够在较短的时间内提取高纯度的RNA，适用于大规模样品的处理。

2. 纯度高：该方法能够有效去除DNA、蛋白质和其他杂质，获得高纯度的RNA。

总rna的提取方法

总RNA（total RNA）是指从细胞或组织中提取出来的包含所有类型的RNA的混合物。下面是一种常见的总RNA提取方法：

1. 细胞/组织样品准备：收集足够数量的细胞或组织样品，并将其保存在适当的缓冲液中（如RIPA缓冲液）。

2. 细胞破碎：将细胞样品经过离心等步骤，去除缓冲液，然后加入细胞破裂缓冲液（常见的破裂缓冲液成分包括TRIzol、RLT缓冲液等），使用搅拌器或超声波进行细胞破碎。

3. RNA提取：加入氯仿或类似的有机物，进行混匀，离心，使得混合液分为上清液（含有DNA和RNA）和有机相（含有脂质和蛋白质）。

4. 上清液沉淀：将上清液转移至新的管中，加入同等体积的异丙醇，轻轻混匀，离心15分钟以使RNA沉淀。

5. RNA洗涤：轻轻倒掉上清液，用70%乙醇洗涤RNA沉淀，再次离心。

6. RNA溶解：将RNA沉淀干燥，加入适当的RNase-free水溶解RNA。

7. RNA质量检测：使用比色法或荧光法测定RNA浓度和纯度（如比例计算

A260/A280）。

这些步骤是总RNA提取的一般流程，具体的操作步骤可能会因实验目的、样品类型和提取试剂盒等因素而有所不同。同时，为了确保RNA的完整性和减少污染，实验操作中还应遵循严格的无RNase和无DNA污染的条件。

一种从动物软骨组织提取rna的方法与流程

一种从动物软骨组织提取rna的方法与流程动物软骨组织提取RNA是一项重要的实验技术，它可以帮助我们

了解RNA在生物体内的功能以及与疾病相关的变化。下面我将介绍一

种常用的提取RNA的方法和流程，希望能对你的研究有所帮助。

首先，我们需要准备动物的软骨组织样本。可以选择小鼠、大鼠

等实验动物作为研究对象，根据需要选择相应的软骨组织（如关节软骨、气管软骨等）。收集样本时要注意保持样本的完整性和新鲜度。

第二步是样本的处理。将收集到的软骨样本迅速放入离心管中，

添加适量的缓冲液，如TRIzol试剂，用冰冻离心机将样本离心以去除

其他组织的干扰。随后，使用组织绞碎器或刀片将软骨组织完全破碎

成非常细小的颗粒。

接下来，将细小的软骨碎片转移至新的离心管中，并添加适量的

酚/氯仿试剂，充分混匀。这一步的目的是将RNA与其他组织成分分离。

然后，用离心机将样本离心，以分离RNA与其他成分。在离心的

过程中，RNA会析出到上层的水相中。将上层水相转移至新的离心管中，并添加异丙醇等沉淀剂，留置一段时间以沉淀RNA。

接下来，用离心机将样本离心以沉淀RNA。沉淀后的RNA形成一个白色半透明的颗粒，底部为酚/氯仿相，上层为异丙醇相。

接下来是重要的洗涤步骤，首先用70％乙醇洗涤RNA沉淀颗粒，

以去除污染物。在洗涤的过程中，轻轻颠倒离心管以将RNA彻底洗涤。

最后，用离心机将样本离心，以去除洗涤过程中残留的乙醇。将

离心管倾斜，使用吸管吸除残留的乙醇即可。

提取RNA的方法和流程非常简单，但需要注意几个关键点。首先，实验中所有操作必须在无RNase的环境下进行，避免RNase污染破坏RNA。其次，在提取过程中要尽量避免样本的氧化和降解。最后，提取

小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR实验

RT-PCR：RNA的反转录 + cDNA的PCR
RT-PCR操作步骤
5x Prime Script Buffer
Prime Script RT Enzyme Mix
Oligo dT primer (50 m)
Random 6 mers (`100 m)
提取的RNA
RNase Free 水
37℃ 85℃
RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
三、实验步骤
RNA提取 1、新鲜肝组织置EP管中，加200l Trizol充分研磨后，补加
800l Trizol，枪头吹匀。 2、加入200l 氯仿，剧烈震荡15秒，4℃ 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50l DEPC水中。
小鼠肝Leabharlann Baidu织RNA提取及 RT-PCR
一、试剂及材料
1、小鼠肝脏 2、DEPC处理过的EP管、PCR管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、DEPC水
二、实验原理
TRIZOL：异硫氰酸胍 + 苯酚
裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。
促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层。

从动物组织中提取总RNA的CTAB法

ｂｏｅｈｌｇｅｅｒｈａｄａｌａｉｎ．ｎｔｉｐｐｒａｔｒｓｕｙｎａｉｕａｔｒｆｅｔｎｉｔｃｎｏｏｙｒｓａｃｎｐｐｉｔｏＩｈｓａｅ．ｆｅｔｄｉｇｖｒｏｓｆｃｏｓａｆｃｉｇＲＮＡｘｒｃｉｎｑａｉｔｃｅｔａｔｕｌｙｗｉｏｔｈ
ＲＡ提取。ＣＡ法所用的试剂均为常规试剂，并日与Ｎ的ＴＢ．
末，将粉末状样品转移至预热好的装有ＣＡ提取缓冲液离心ＴＢ管中，混合均匀。在６￣水浴加热５ｉ，其问每隔２ｉ轻轻５Ｃｍｎｍｎ
ＤＡＮ的提取等其他分子生物学实验的试剂相似，给实验的
准各和试剂的购买带来了简便。我们分析提取过程中各种
影响因素后，尝试用改进的ＣＡ法提取动物总ＲＡＴＢＮ，获得
的摇匀。③ 向混合物中先加入１０Ｌｍ１ＬａＣＨ．～２￣２ｏ／的ＮＡ，Ｐ４Ｏ
。
１２方法．
１．Ｎ的提取．１Ａ２Ｒ
本研究采用的方法在李靓芳ＣＡ法的基础上，进行了ＴＢ

总RNA的提取和检测实验报告

实验二总RNA的提取和检测

实验目的

1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法；

2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法；

3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱；

实验原理

（一）概述

1. 10-5 µg RNA/细胞含有rRNA 80-85%：28S 18S 5S

tRNA, snRNA 10-15%

mRNA 1-5%

2. mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

3.RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

4.目前常用的是Trizol法。

（二）Trizol的主要成分

1.Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。

2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。

4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。

(三)总RNA的纯度检测原理：

不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。

动物组织细胞总RNA的抽提及检测(TRIzol法)

动物组织/细胞总RNA的抽提及检测（TRIzol法）

背景知识：

细胞质总RNA中，有rRNA、tRNA、mRNA等。绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、干扰素和有些组蛋白mRNA外）的3’端存在20~250个多聚腺苷酸PolyA。利用此特性，可很方便得从总RNA中，用寡聚（dT）亲和层析柱分离出mRNA。

RNA分离的关键因素是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNase以外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液以及唾液中均存在RNase。这类酶耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性可使之暂时失活，但在变性剂去除后，又可恢复活性。所以在实验的操作过程中，应尽量减少RNAse污染的机会。在整个操作过程中，在一个洁净的环境中，戴手套和口罩，所用的器皿、水和试剂需用焦炭酸二乙酯（DEPC 很强的RNAse抑制剂）处理过。

玻璃器皿的处理。在常规洗净后，应用0.1% DEPC浸泡2h以上，再用双蒸水漂洗几次，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4h以上。塑料器材应用一次性的、新的，在使用前高压消毒，严格一些可以用0.1%DEPC浸泡过夜，高压灭菌。所用试剂应加DEPC至0.05%~0.1%，室温过夜，然后高压处理。但是，Tris与DEPC反应，所以在配制Tris时，应用DEPC处理过的水配制，最好再高压消毒。

方法一：

1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于研钵中，用剪刀剪碎组织，研钵中加入少量液氮，迅速研

磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨成粉末状，每100mg组织加入1ml TRIzol，在水浴中迅速匀浆15~30秒，以充分研碎组织。然后，将细胞悬浮液吸入另一1.5ml微量离心管中，室温下静置5min。

动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲PPT教案

概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
RNA提取
RNA的提取步骤
11、将上层水相溶液小心转移至新的EP管中，大约每个EP管中能取出400~500μl，谨慎操作，切勿吸到中间层。（注：下层有机废液勿乱丢，收集起来统一进行无毒化处理。） 12、加入等体积异丙醇，上下颠倒EP管，充分混匀。 13、室温静置10 min后，4℃，13000rpm离心10 min。可在离心后的EP管底部观察到少量的白色沉淀。
概要
RNA 提取
RT-PCR
Q-PCR
注意事项总结
RNA提取
RNA的浓度及质量检测
2、质量检测—凝胶电泳法
实验操作：
1）取10μl RNA原液至一个1.5ml EP管中，使用RNasefree ddH2O将其稀释至200ng/μl。
注：需 RNase-free ddH2O 体积 (μl)=[10μl×RNA 浓度 (ng/μl) /200(ng/μl)]10μl
若观察到smear现象，或比值小于2:1，则RNA已发生降解。
如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组DNA污染，这时可以考虑使用DNase I 处理。
若有条带，可能混入了基因组DNA
28S rRNA 18S rRNA
tRNA等
DL2000 DNA Marker 电泳图（1%琼脂糖胶，TAE）

小鼠组织总RNA提取

总RNA提取

1. 取50－100 mg（新鲜或－70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml匀浆器中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室温静置10 min。

2. 加入0.2 ml氯仿，振荡15s，静置10 min。

3. 4℃离心，12000 g×15 min，取上清置另一1.5ml离心管中。（宁少勿多）

4. 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5. 4℃离心，12000g×10 min，弃上清。

6. 加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5 min，弃上清。（DEPC处理的水配制）

7. 晾干，加入适量的DEPC H 2 O溶解（65℃促溶10～15 min）。

8. 快速电泳检测RNA完整性。

图1：完整的RNA与降解的RNA之间的比较。分别取2微克的降解总RNA及完整总RNA 与Ambion的RNA Millennium Markers™一同进行1.5%的变性琼脂糖凝胶电泳。在完整

RNA样品中可以清楚地观察到18S和28S核糖体RNA。而降解的RNA则表现为较低分子

量的弥散。

纯RNA：1.7 ＜OD260/280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）。纯RNA的OD260/230比值为2.5，若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类），盐类或有机溶剂污染。（OD260/OD230与OD260/OD280均用于判断RNA 纯度）

注意事项：

1.样品量和TRIzol的加入量一定要按照步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少TRIzol 量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。1 ml 的Trizol 最多只能裂解100 mg 的组织。Trizol 里面是含有RNA 酶抑制剂的，如果组织过量，Trizol 无法完全浸润组织无法完全裂解组织，多余组织内的RNA 酶等物质会导致RNA 的降解。这是RNA 降解的很重要的原因。

动物总RNA提取

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动物组织总RNA的提取的提取动物组织总
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实验目的及原理
实验注意事项
实验步骤及结果分析
思考题
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1.1 实验目的
掌握Trizol法提取组织总RNA的原理及方法了解RNA相关操作中的注意事项了解检测RNA质量的相关指标
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3.1 实验步骤
4℃ 12000rpm离心 3min，尽量弃上清。室温晾干5-10min，不要过于干燥。 20µl RNaseFree H2O溶解RNA样品。 1.2%琼脂糖凝胶检测。
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3.2 结果分析
呈现出3条 rRNA带，分别是5s、18s、 28s rRNA的带。 28s亮度是18s 亮度的二倍。
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2 RNA酶污染的防止酶污染的防止所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤6hr或更长时间。塑料器皿(EP管、Tips等)用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯 )12hr以上，高压灭菌后备用。操作人员戴一次性手套，实验过程中手套要勤换。
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4 思考题
DEPC的作用是什么？DEPC处理过的制品试剂为什么要灭菌？高质量的RNA有什么特点？除了Trizol法你还知道有什么方法用来提取RNA？