科域—细菌转化 8.9
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细菌转化实验
讲师： ***博士
目 录
质粒的转化 感受态细胞 细菌转化的基本原理 转化实验的基本步骤 疑难解析
01
质粒的转化
1.1 质粒转化的目的 1.2 质粒转化的步骤 1.3 外源DNA片段与载体的连接重组 1.4 限制性酶切位点的特征 1.5 插入外源基因
1.1. 质粒转化目的
1
放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测等
开的质粒 DNA 片段重新连接成一个环状
的 DNA 分子，即把目的基因 DNA插入质粒 DNA，实现了质粒重组。
1.4. 限制性酶切位点的特征
限制性内切酶指能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链 核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 具有特异的识别核酸序列，称为酶切位点 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基
② 菌落太多，无法 挑取单克隆
③ 菌落分布不均匀 ④ 平板上有杂菌 ⑤ 转化效率低
① 涂板时，未 将菌液稀释
②抗生素过期或 者失效 ③感受态菌株被 污染
③更换感受态
④提高适度的DNA量 ⑤涂板时，玻璃棒冷 却至室温 ⑥ 用电击法获得较 高效率的转化效率
④多方面的原因
《细菌转化与细胞转染技术》系列
04
转化实验的基本步骤
4. 转化实验基本步 骤
1） 在两只无菌离心 管上分别标记 +DNA, -DNA 。 2） 在上述两管中分 别加入250 μ l 转 化液。 3) 迅速置于冰上。
4） 各挑取活化好的 受体菌的一个单菌落 ，悬浮于两管转化液 中。
5） 在标有 +DNA 的 管中加入一环质粒 DNA ，而标有 -DNA 的管中不加。 6） 将上述两管于冰 上放置 10min 。 7） 在准备好的培养
重组质粒 重组质粒 短暂热刺激或电击
CaCl2 低温
野生型E.coli
感受态细胞
03
细菌转化的基本原理
3. 细菌转化的基本原 理
转化：是指将质粒导入细菌内，以扩增质粒或 在细菌内表达质粒所携带的基因
电击法
转化方法
热激法
热激法示意图
3.1 重组质粒的筛选与鉴定
3.2. 重组质粒的筛选与鉴定
半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统在质粒中 含有 LacZ 基因 的 a- 肽序列， 当 无外源 DNA片段插入时，质粒表达a 肽，它与宿 主菌的 Lac ZM15基因的产物互补，产生 有活性的B-半乳糖苷酶，在含有指示剂 X-gal 和诱导剂 IPTG 存在的情况下，菌 落呈蓝色（质粒自身环化）；在外源基 因插入后LacZ基因的阅读框架被破坏， 细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈 白色（阳性克隆）。
05
疑难解析
5. 疑难解析
可能原因 解决方法
①用于转化的 DNA是否降解 ① 平板无菌落形成 ②感受态失效 ③质粒抗性是 否弄混 ④涂板时中操 作部当
①可通过琼脂 糖凝胶电泳验 证 ②重新制作感 受态并转化
③检查质粒抗 体 ④涂板过程中 必须严谨
可能原因 可能出现问题
解决方法 ①稀释菌液 ②重新倒平板
基团的末端 。
1.5 插入外源DNA
外源DNA和质粒是用同样的两个酶切，然后构建成含有外源基因的质粒
目标DNA
质粒载体
02感Βιβλιοθήκη 态细胞2. 感受态细胞(Competent Cells)
野生型E.coli不容易转化，通过化学等特殊 方法处理E.coli 细胞，改变其膜对DNA的通 透性，这种细胞就称为感受态细胞，即细胞 处于能摄入核酸分子时的生理状态。
8 ）两只小管放入 42 ℃ 水浴中处理 50 秒， 再迅速放于冰上 2 min 。 9 ）在两只小管中分别 加入 250 μ l LB- 肉 汤。 10 ）从 +DNA 小管中分 别吸取 100 μ l 滴加 在两个标有 +DNA 的平 板上，从 -DNA 小管中 分别吸取 100 μ l 滴 加在两个标有 -DNA 的 平板上。11 ）用无菌接 种环将滴加的液体均匀 涂布在平板上。 12 ）将上述四只平板固 定，并于 42 ℃ 培养箱 中培养 2 天。13 ）在 长波紫外灯下观察结果 ，记录各平板上的菌落
2
3 4 5
携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达
PCR产物的克隆和测序 构建基因库、cDNA库
纯化基因片段
1.2. 质粒转化的步骤
外源DNA片段的获得
3种方式： ① PCR扩增出的基因组片段
② cDNA
③ 化学方法人工合成的DNA片段
1.3. 外源DNA片段与载体的连接重组
可采用由 Hind III 切割开的 pUC19 质粒， 用 T4 噬菌体 DNA连接酶将 PCR 片段与切割
讲师： ***博士
目 录
质粒的转化 感受态细胞 细菌转化的基本原理 转化实验的基本步骤 疑难解析
01
质粒的转化
1.1 质粒转化的目的 1.2 质粒转化的步骤 1.3 外源DNA片段与载体的连接重组 1.4 限制性酶切位点的特征 1.5 插入外源基因
1.1. 质粒转化目的
1
放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测等
开的质粒 DNA 片段重新连接成一个环状
的 DNA 分子，即把目的基因 DNA插入质粒 DNA，实现了质粒重组。
1.4. 限制性酶切位点的特征
限制性内切酶指能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链 核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 具有特异的识别核酸序列，称为酶切位点 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基
② 菌落太多，无法 挑取单克隆
③ 菌落分布不均匀 ④ 平板上有杂菌 ⑤ 转化效率低
① 涂板时，未 将菌液稀释
②抗生素过期或 者失效 ③感受态菌株被 污染
③更换感受态
④提高适度的DNA量 ⑤涂板时，玻璃棒冷 却至室温 ⑥ 用电击法获得较 高效率的转化效率
④多方面的原因
《细菌转化与细胞转染技术》系列
04
转化实验的基本步骤
4. 转化实验基本步 骤
1） 在两只无菌离心 管上分别标记 +DNA, -DNA 。 2） 在上述两管中分 别加入250 μ l 转 化液。 3) 迅速置于冰上。
4） 各挑取活化好的 受体菌的一个单菌落 ，悬浮于两管转化液 中。
5） 在标有 +DNA 的 管中加入一环质粒 DNA ，而标有 -DNA 的管中不加。 6） 将上述两管于冰 上放置 10min 。 7） 在准备好的培养
重组质粒 重组质粒 短暂热刺激或电击
CaCl2 低温
野生型E.coli
感受态细胞
03
细菌转化的基本原理
3. 细菌转化的基本原 理
转化：是指将质粒导入细菌内，以扩增质粒或 在细菌内表达质粒所携带的基因
电击法
转化方法
热激法
热激法示意图
3.1 重组质粒的筛选与鉴定
3.2. 重组质粒的筛选与鉴定
半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统在质粒中 含有 LacZ 基因 的 a- 肽序列， 当 无外源 DNA片段插入时，质粒表达a 肽，它与宿 主菌的 Lac ZM15基因的产物互补，产生 有活性的B-半乳糖苷酶，在含有指示剂 X-gal 和诱导剂 IPTG 存在的情况下，菌 落呈蓝色（质粒自身环化）；在外源基 因插入后LacZ基因的阅读框架被破坏， 细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈 白色（阳性克隆）。
05
疑难解析
5. 疑难解析
可能原因 解决方法
①用于转化的 DNA是否降解 ① 平板无菌落形成 ②感受态失效 ③质粒抗性是 否弄混 ④涂板时中操 作部当
①可通过琼脂 糖凝胶电泳验 证 ②重新制作感 受态并转化
③检查质粒抗 体 ④涂板过程中 必须严谨
可能原因 可能出现问题
解决方法 ①稀释菌液 ②重新倒平板
基团的末端 。
1.5 插入外源DNA
外源DNA和质粒是用同样的两个酶切，然后构建成含有外源基因的质粒
目标DNA
质粒载体
02感Βιβλιοθήκη 态细胞2. 感受态细胞(Competent Cells)
野生型E.coli不容易转化，通过化学等特殊 方法处理E.coli 细胞，改变其膜对DNA的通 透性，这种细胞就称为感受态细胞，即细胞 处于能摄入核酸分子时的生理状态。
8 ）两只小管放入 42 ℃ 水浴中处理 50 秒， 再迅速放于冰上 2 min 。 9 ）在两只小管中分别 加入 250 μ l LB- 肉 汤。 10 ）从 +DNA 小管中分 别吸取 100 μ l 滴加 在两个标有 +DNA 的平 板上，从 -DNA 小管中 分别吸取 100 μ l 滴 加在两个标有 -DNA 的 平板上。11 ）用无菌接 种环将滴加的液体均匀 涂布在平板上。 12 ）将上述四只平板固 定，并于 42 ℃ 培养箱 中培养 2 天。13 ）在 长波紫外灯下观察结果 ，记录各平板上的菌落
2
3 4 5
携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达
PCR产物的克隆和测序 构建基因库、cDNA库
纯化基因片段
1.2. 质粒转化的步骤
外源DNA片段的获得
3种方式： ① PCR扩增出的基因组片段
② cDNA
③ 化学方法人工合成的DNA片段
1.3. 外源DNA片段与载体的连接重组
可采用由 Hind III 切割开的 pUC19 质粒， 用 T4 噬菌体 DNA连接酶将 PCR 片段与切割